1.研究背景与目的:根尖周炎是一种由细菌感染根管系统引起的骨质破坏的疾病。临床上的根管治疗并不能完全生物性修复根尖周疾病造成的牙槽骨缺损。很大一部分原因与病损区骨再生能力下降有关。随着近年来对干细胞在组织骨再生领域的研究不断深入,运用干细胞移植促进感染性骨缺损修复成为目前最有前景的治疗方法。由于人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）具有来源丰富、取材方便、易于培养且无伦理学障碍等优点,我们拟采用hDPSCs移植治疗根尖周炎骨缺损。细胞移植成功的关键在于干细胞生物学功能的维持。大量研究证实病损区缺血缺氧等恶劣环境能抑制干细胞功能的发挥,甚至导致细胞死亡。因此,在细胞移植前对其预处理成为一种有效地提高干细胞生物活性的手段。其中,缺氧预处理不仅简单快速,而且成效显著。有研究表明,骨髓干细胞在缺氧预处理后归巢能力增强,明显促进缺血性脑卒中的治疗效果;经过缺氧预处理的人脐带血干细胞移植到小鼠后肢缺血模型中,小鼠的损伤部位呈现出更强的成血管能力。然而,到目前为止,尚无缺氧预处理是否影响hDPSCs治疗感染性骨缺损效果的报道。探索这一问题有助于进一步了解hDPSCs移植在感染性骨组织再生修复中的作用。本研究通过体外培养hDPSCs并对其进行缺氧预处理,观察hDPSCs静脉注射至根尖周炎小鼠后根尖周区牙槽骨的骨再生修复效果,为干细胞治疗感染性骨缺损提供一定依据。2.研究材料与方法:人牙髓组织来自于因正畸治疗需要拔除的健康的前磨牙或第三磨牙,年龄在8¹4岁。无菌条件下,用酶消化结合组织贴壁法原代培养人牙髓干细胞。取3⁶代的细胞用于实验。对于需常氧处理的细胞,hDPSCs放在含21%O₂,74%N₂和5%CO₂常氧培养箱;对于需缺氧处理的细胞,hDPSCs放在精确调控的含3%O₂,92%N₂和5%CO₂的缺氧培养箱。[1]采用细胞免疫荧光实验、流式细胞术检测细胞表面抗原及细胞成骨、成脂诱导实验,来鉴定提取培养的细胞具有干细胞的特性。[2]通过茜素红染色和细胞免疫荧光实验的方法来检测缺氧预处理后hDPSCs的成骨分化能力。[3]采用RT-PCR和Western blot的方法检测缺氧预处理hDPSCs成骨相关基因m RNA和蛋白的表达情况。[4]通过建立小鼠根尖周炎模型的方法来研究细胞治疗效果。[5]运用切片HE染色、Trap染色及免疫组化实验,来观察和对比注射常氧和缺氧hDPSCs到模型小鼠体内后,其根尖周炎症的变化、破骨细胞的数量及细胞成骨分化的能力。[6]运用Micro CT的方法评价两种情况下小鼠根尖周炎牙槽骨组织的再生修复效果。3.研究结果:[1]经鉴定培养的hDPSCs波形蛋白表达呈阳性,角蛋白表达阴性;间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105、CD146和STRO-1表达阳性,造血干细胞表面抗原CD34和CD45表达阴性;另外该细胞具有良好的成骨和成脂等多向分化潜能。[2]缺氧预处理能促进hDPSCs的成骨分化。[3]缺氧预处理可以明显促进hDPSCs的Runx2,Sp-7,VEGF和CD45的表达。[4]根尖周炎小鼠模型的局部病变组织切片经HE染色可见根尖周炎症病损及骨破坏在开髓后第7天开始形成,7¹4天进入根尖周炎急性期,21²8天进入慢性期,表明根尖周炎模型成功建立。[5]与注射PBS空白组相比,hDPSCs移植后的小鼠根尖周炎症反应及骨破坏程度受到抑制。且与hDPSCs常氧组相比,移植hDPSCs缺氧组的小鼠根尖周炎症反应及骨破坏受到更加明显地抑制,根尖破骨细胞显著减少,与此同时,骨缺损部位的成骨相关蛋白Runx2、BMP2、OCN表达阳性细胞显著增多,这些结果表明缺氧预处理hDPSCs不仅能抑制骨缺损区炎症反应,而且增强骨损伤部位的细胞成骨分化能力。[6]Micro CT的结果显示,缺氧预处理hDPSCs能显著增强骨缺损部位的骨组织再生及修复效果。4.研究结论:此研究证实人牙髓干细胞经缺氧预处理后,人牙髓干细胞体外成骨分化能力明显提高,体内可显著促进根尖周炎骨缺损再生,为人牙髓干细胞作为优良的种子细胞应用于修复感染性骨缺损提供一定的理论基础。