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目的中药女贞子（Ligustri lucidi Fructus）具有滋阴补肾、调节免疫、抗炎、抗衰老等药理作用。大量研究发现,女贞子的炮制品酒女贞子可增强其滋补肝肾的作用,其与淫羊藿配伍的药对也常用来研究因肾阴阳两虚所致骨质疏松症的调理,更有以药对女贞子-淫羊藿为君药的制剂仙贞扶正颗粒临床用于肿瘤患者提高机体免疫力。基于此,本课题旨在探究女贞子及其复方制剂对化疗药顺铂致大鼠肾毒性的保护作用及潜在作用机制。首先,比较酒女贞子对三种不同种类化疗药致大鼠肝肾损伤的保护作用强弱,明确酒女贞子对何种化疗药诱导肝肾损伤的保护作用显著;其次,探究酒女贞子对等效剂量顺铂以不同给药频次建立大鼠肝肾损伤模型的保护作用;最后,探讨女贞子及其复方制剂对临床等效剂量顺铂单次注射大鼠致肾损伤的保护作用,为阐述女贞子及其复方制剂的临床应用提供科学依据。方法1、酒女贞子对三种化疗药致肝肾损伤的保护作用:将雄性大鼠按体重随机分为对照组、模型组、酒女贞子（高、中、低剂量）组及酒女贞子高剂量单用组,每组8只。1)顺铂建立大鼠肝肾损伤模型的分组及给药:对照组每日灌胃蒸馏水25 mg/kg,连续7 d;模型组于第5 d腹腔注射顺铂8 mg/kg;酒女贞子高、中、低剂量组于第5 d注射顺铂8 mg/kg,并在造模第一天开始分别每日灌胃400mg/kg、200 mg/kg和100 mg/kg酒女贞子提取物,连续7 d;酒女贞子高剂量单用组每日灌胃400 mg/kg,,连续7 d。2)5-氟尿嘧啶建立大鼠肝肾损伤模型的分组及给药:对照组每日灌胃蒸馏水25 mg/kg,连续14 d;模型组于第9至14d腹腔注射5-氟尿嘧啶20 mg/kg;酒女贞子高、中、低剂量组于第9至14 d每日腹腔注射5-氟尿嘧啶20 mg/kg,并在造模第一天开始分别灌胃400 mg/kg、200mg/kg和100 mg/kg酒女贞子提取物,连续14 d;酒女贞子高剂量单用组每日灌胃400 mg/kg,连续14 d。3)环磷酰胺建立大鼠肝肾损伤模型的分组及给药:对照组每日灌胃蒸馏水25 mg/kg,连续21 d;模型组于第16 d腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg;酒女贞子高、中、低剂量组于第16 d腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg,并在造模第一天开始分别灌胃400 mg/kg、200 mg/kg和100 mg/kg酒女贞子提取物,连续21 d;酒女贞子高剂量单用组每日灌胃400 mg/kg,连续21 d。给药结束后,分别计算大鼠体重变化率和肝肾脏器指数,检测血清肝功能生化指标和肾功能生化指标,并观察肝肾的组织病理学变化。2、酒女贞子对临床等效剂量顺铂不同注射次数致大鼠肝肾损伤模型的保护作用:将Wistar雄性大鼠按体重随机分为对照组、模型组和酒女贞子等效剂量组,每组10只。1)大鼠单次注射临床等效剂量顺铂致肝肾损伤模型:除对照组外,其他两组大鼠于第4 d腹腔注射顺铂3 mg/kg,酒女贞子等效剂量组并于第1 d开始灌胃200 mg/kg提取物,连续7 d。2)大鼠两次注射临床等效剂量顺铂致肝肾损伤模型:除对照组外,其他两组大鼠于第4 d和第8 d腹腔注射顺铂3mg/kg,酒女贞子等效剂量组并于第1 d开始灌胃200 mg/kg提取物,连续10 d。实验结束后,分别计算大小鼠体重变化率和肝肾脏器指数,检测血清肝功能生化指标和肾功能生化指标,并观察肝肾组织H＆E染色的病理变化。3、女贞子及其复方制剂对等效剂量顺铂诱导大鼠肾损伤的保护作用研究:将Wistar雄性大鼠按体重随机分为对照组、模型组、女贞子组、药对（女贞子-淫羊藿）组和复方制剂（仙贞扶正颗粒）组,每组10只。除对照组外,其他四组均于第4 d腹腔注射顺铂3 mg/kg;女贞子组灌胃200 mg/kg;药对组灌胃350mg/kg;复方制剂组灌胃120 mg/kg,连续给药7 d。取材结束后,除了考察大鼠体重变化率、脏器指数、肾功指标和病理变化外,采用免疫组化法观察大鼠肾脏KIM-1和NOX4阳性信号的表达和分布;Western Blot法检测女贞子及其复方制剂对顺铂致肾毒性大鼠肾脏KIM-1、NOX4、Nrf-2、HO-1和NF-k B蛋白表达的影响;试剂盒法检测大鼠肾组织中MDA、SOD、CAT、GSH和NADP+/NADPH水平的变化;ELISA法检测女贞子及其复方制剂对大鼠肾组织中IL-1b、IL-6和TNF-a水平的影响;除此之外,利用石墨炉原子吸收法对大鼠肾组织中铂原子浓度进行检测。结果1、在实验第一天和最后一天记录大鼠体重,取材后分别称取肝肾组织的重量,发现三种化疗药均使大鼠体重增长缓慢,其中5-氟尿嘧啶抑制大鼠生长最为显著（P＜0.05）,给予酒女贞子后,大鼠体重增长缓慢有所改善,且具有剂量依赖性;与对照组相比,三种化疗药均使肝肾脏器指数明显升高（P＜0.05）,酒女贞子干预后,肝脏器指数无明显变化,肾脏器指数均有降低趋势,但无显著性差异。顺铂诱导大鼠肝肾损伤实验的血清生化结果为:与对照组相比,模型组肝功指标ALT、AST、ALP、TP、ALB和GLO显著性降低（P＜0.05）,肾功指标BUN升高6倍、CREA升高7倍和UA降低5倍,均有统计学差异（P＜0.05）;给予酒女贞子后,与模型组相比,TP、ALB和GLO呈剂量依赖性显著升高（P＜0.05）且高剂量酒女贞子可使BUN和CREA显著性降低,UA显著性增加（P＜0.05）。5-氟尿嘧啶诱导大鼠肝肾损伤实验的血清生化结果为:与对照组相比,模型组肝功能指标除ALB外,其他指标均显著性降低（P＜0.05）,肾功指标CREA明显升高（P＜0.05）,BUN升高和UA降低,但无显著性差异;酒女贞子干预后,与模型组相比,仅高剂量酒女贞子对AST、TP、GLO有显著的缓解作用,对CREA呈剂量依赖方式显著降低（P＜0.05）,对其他指标均无明显缓解作用。环磷酰胺诱导大鼠肝肾损伤实验的血清生化结果为:与对照组相比,模型组肝功指标ALT显著升高（P＜0.05）,AST和ALP显著降低（P＜0.05）,其他相关指标无明显变化,肾功BUN和CREA显著性升高（P＜0.05）,UA显著性降低（P＜0.05）;酒女贞子干预后,与模型组相比,肝功指标并无明显的逆转,肾功指标中仅UA显著性升高（P＜0.05）。由肝脏病理H＆E染色可知,大鼠暴露于三种化疗药之下肝脏病变严重,表现为炎症细胞浸润,肝细胞肿胀、坏死及核固缩;酒女贞子干预后病理现象也无显著性逆转。由肾脏病理H＆E染色可知,大鼠暴露于三种化疗药之下肾脏病变机理不同,顺铂模型组大鼠肾小管管腔变形,肾小管上皮细胞脱落坏死;5-氟尿嘧啶模型组大鼠肾脏出现中性粒细胞浸润和间质出血;环磷酰胺模型组大鼠肾小球萎缩,且炎症细胞浸润显著,给予酒女贞子后,对5-氟尿嘧啶和环磷酰胺致大鼠肾损伤病理改善并不显著,但对顺铂致肾损伤的病理有缓解作用。2、在大鼠单次注射临床等效剂量顺铂致肝肾损伤实验中,与对照组相比,模型组大鼠体重增长缓慢,肝脏器指数无明显变化,肾脏器指数显著性升高（P＜0.05）,给予酒女贞子后,大鼠体重降低程度有所缓解,肾脏器指数降低;血清生化结果表明,大鼠肝功和肾功指标ALT、AST、GLO、BUN、UA和CREA水平显著升高（P＜0.05）,酒女贞子干预后,大鼠仅肾功BUN和UA水平显著降低（P＜0.05）,其他指标均无显著性变化;大鼠肝组织病理表现为肝细胞肿胀、空泡化及炎症细胞浸润,肾组织病理表现为肾小管出现管腔变形和刷状缘膜缺失,给予酒女贞子后,可显著改善大鼠肾损伤病理现象,对大鼠肝脏损伤并无明显的逆转作用。在大鼠两次注射临床等效剂量顺铂致肝肾损伤实验中,与对照组相比,模型组大鼠体重显著性降低（P＜0.05）,肾脏器指数显著性升高（P＜0.05）,肝脏器指数无明显变化,酒女贞子干预后,大鼠体重的降低有所逆转,肾脏器指数也明显下降（P＜0.05）;血清生化结果表明,大鼠ALT、TP、BUN和CREA水平明显增高（P＜0.05）,其他指标均无显著性改变,给予酒女贞子后,大鼠ALT和TP水平明显降低（P＜0.05）,肾功指标均无显著性变化;通过考察大鼠的组织病理学变化,发现大鼠肝细胞呈现出明显的肿胀、局部弥散性出血及炎症细胞浸润,肾小管出现严重扩张和刷状缘膜缺失,酒女贞子治疗后,肝肾组织病理片子仍观察到上述现象,没有缓解作用。3、在大鼠注射临床等效剂量顺铂致肾损伤实验中,与对照组相比,模型组体重变化率显著降低,肾脏器指数显著升高（P＜0.05）,BUN和UA明显升高（P＜0.05）,女贞子及其复方制剂干预后,体重无明显变化,复方制剂组肾脏器指数显著降低（P＜0.05）,药对组和复方制剂组BUN和UA恢复到正常值;肾组织H＆E染色表明,与对照组相比,模型组大鼠肾小管管腔变形、上皮细胞坏死和刷状缘膜缺失,给予女贞子及其复方制剂后,病理现象有所好转;通过免疫组化法考察KIM-1和NOX4的蛋白表达和分布,发现模型组肾组织中KIM-1和NOX4阳性信号表达强烈,药对和复方制剂分别干扰后均使其阳性表达降低;除此之外,药对和复方制剂可激活Nrf-2/HO-1抗氧化通路,上调Nrf-2和HO-1的蛋白表达并降低抗氧化酶SOD、CAT和GSH的水平,还可抑制炎症因子TNFa、IL-6和IL-1b的释放和NF-k B蛋白的表达,从而发挥女贞子及其复方制剂的肾保护作用。结论在三种化疗药分别诱导的肝肾损伤大鼠模型中,酒女贞子对远超临床等效剂量顺铂诱导的肾损伤有显著的保护作用,但注射顺铂的造模剂量与临床给药剂量有所悬殊。为使本实验研究更具临床实际意义,改变模型诱导方案,研究酒女贞子对等效剂量顺铂在不同给药次数诱导大鼠肝肾损伤模型的保护作用,结果发现酒女贞子对顺铂单次腹腔注射顺铂诱导大鼠肾损伤模型有显著的肾保护作用。同时,中药是在配伍（即两种或多种药物配合使用）下发挥增强疗效的作用,故进一步考察女贞子及其复方制剂对顺铂肾毒性的保护作用和分子机制,发现药对和复方制剂通过激活Nrf-2/HO-1抗氧化通路,升高SOD、CAT和GSH的水平,抑制NF-k B蛋白表达和炎症因子TNF-a、IL-6和IL-1b的释放,发挥对顺铂诱导肾损伤的保护作用。