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目的：研究淋巴细胞主动免疫治疗不明原因反复自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)的免疫效应机制：1.通过比较研究淋巴细胞主动免疫治疗前后URSA患者血清中封闭抗体(blocking antibody, BA)水平的变化,探讨淋巴细胞主动免疫治疗URSA的体液免疫效应机制；2.通过比较研究淋巴细胞主动免疫治疗前后URSA患者T细胞增殖功能的变化,探讨淋巴细胞主动免疫治疗URSA的细胞免疫效应机制；3.比较淋巴细胞主动免疫治疗前后URSA患者Th17和Treg免疫细胞水平的变化,探讨淋巴细胞主动免疫治疗URSA的免疫调节细胞效应机制；4.寻找评价淋巴细胞主动免疫治疗URSA有效与否的生物学标记和检测指标。方法：1.淋巴细胞主动免疫治疗URSA研究选用URSA患者的配偶作为淋巴细胞供者,治疗前供者应先做乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、HIV病毒筛查,如配偶筛查不合格则选用无血缘关系的健康第三方作为淋巴细胞供者,实验室检查要求同上。抽取供者静脉血于肝素抗凝管中,无菌条件下分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)洗涤2次后配成淋巴细胞浓度为(2～4)×107个/ml的生理盐水悬液,于患者前臂皮下注射治疗。2.封闭抗体(BA)检测2.1补体依赖微量淋巴细胞毒试验(complement-dependent cytotoxicity, CDC)检测BA：抽取患者静脉血并分离血清备用；抽取供者肝素抗凝静脉血并分离出PBMC,用生理盐水调整节细胞浓度至2×106个／ml。按操作说明先后分别加入供者PBMC、受者血清、兔补体到Terasaki微孔板对应的各孔中(设置阴性对照和阳性对照),置于37℃孵育,然后加入FQAE荧光染料染色,于倒置相差显微镜下观察细胞着色情况并计数。2.2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BA：抽取URSA患者静脉血,分离血清,使用ELISA检测试剂盒并按说明书进行操作。设置阴性对照、阳性对照、空白对照。用酶标仪读取各孔0D值,判断各孔反应格局。3.T淋巴细胞增殖功能检测抽取患者肝素抗凝静脉血并分离出淋巴细胞,用细胞培养液调节细胞浓度至2×106个/ml。使用96孔细胞培养板,设置空白组、阴性对照组和实验组,每组设3复孔。实验组加植物血凝素PHA-P,空白组和阴性对照组不加。培养细胞72h,培养结束前4h,每孔加入CCK-8细胞增殖检测试剂,继续培养4h,使用酶标仪读取各孔0D值,计算细胞增殖指数。4.患者Th17、Treg细胞数量检测制备患者淋巴细胞悬液并调整浓度至1×106个/ml,检测Th17细胞时,使用白细胞激活剂刺激Th17细胞分泌IL-17,收集细胞后,经洗涤、表面染色、固定、破膜、胞内染色、洗涤、重悬等处理后,使用流式细胞仪进行检测。实验同时设置阴性对照和同型对照以调节补偿并排除非特异性染色。5.采用SPSS13.0统计软件对研究数据进行统计分析。率的比较使用卡方检验,两样本均数的比较使用t检验。结果：1.111例接受淋巴细胞主动免疫治疗的患者全部再次妊娠,其中有19例再次发生早期自然流产,其余92例继续妊娠者中有81例孕周大于12周,所有接受治疗的患者中未见有明显的不良反应者,治疗成功率72.97%(81/111)。2.CDC法检测封闭抗体结果：36例患者治疗前BA阳性3例,阴性33例,阳性率8.33%(3/36)；16例患者经治疗后BA阳性7例,阴性9例,阳性率43.75%(7/16)；两组比较,治疗后BA阳性率明显高于治疗前(x2=6.81(校正),P<0.01)。ELISA法检测封闭抗体结果：24例患者治疗前BA阳性1例,阴性23例,阳性率4.17%(1/24);34例患者治疗后BA阳性25例,阴性9例,阳性率73.53%(25/34)：两组比较,治疗后BA阳性率明显高于治疗前(x2=27.37,P<0.01)。CDC法与ELISA法检测BA的阳性率比较：所有采用CDC试验检测BA的52例患者中,阳性10例,阴性42例,阳性率为19.23%(10/52)；用ELISA法检测BA的58例患者中,阳性26例,阴性32例,阳性率为44.83%(26/58)；两种方法检出BA的阳性率比较,ELISA法检出BA的阳性率明显高于CDC试验(x2=8.16,P<0.01),差异有统计学意义。3.18例患者治疗前T细胞增殖指数(SI)平均为1.56±0.25,20例患者治疗后T细胞增殖指数平均为1.27±0.22,两组比较,治疗前患者T细胞增殖指数明显高于治疗后,差异有统计学意义(t=3.80,P<0.01)。4.12例患者治疗前CD4+IL-17A+Thl7比例平均2.63±0.64%,CD4+CD25+Foxp3’Treg比例平均3.78±0.76%,Th17/Treg比值平均0.70±0.11；19例治疗后患者CD4+IL-17A+Th17比例平均1.75±0.59%,CD4’CD25’Foxp3’Treg比例平均3.86±0.88%,Thl7/Treg比值平均0.46±0.16。两组比较,治疗前患者CD4+IL-17A+Th17比例明显高于治疗后,差异有统计学意义(t=3.92,P<0.05)；治疗后患者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例与治疗前相比,无统计学差异(t=0.26,P>0.05)；而治疗前Thl7/Treg比值明显高于治疗后Th17/Treg比值(t=4.55,P<0.05)差异有统计学意义。结论：1.对URSA患者进行淋巴细胞主动免疫治疗,可有效提高患者妊娠成功率,减少复发流产的风险。2.淋巴细胞主动免疫治疗可刺激URSA患者体内产生封闭抗体,调节患者体液免疫功能,保证妊娠顺利进行。3.淋巴细胞主动免疫治疗可下调URSA患者T淋巴细胞增殖功能,使妊娠得以继续,T淋巴细胞介导的免疫效应可能在URSA的发病机制和主动免疫治疗效应中起重要作用。4.淋巴细胞主动免疫治疗可使不利于妊娠的Thl7细胞减少,使Thl7/Treg比值降低,有效调节URSA患者体内Th17/Treg平衡,改善患者的细胞免疫功能,使其转向有利于妊娠的正常免疫状态。5.在封闭抗体检测的方法学评估方面,ELISA试验明显优于CDC试验,使用ELISA方法检测封闭抗体可作为判断淋巴细胞主动免疫治疗URSA有效与否的评估手段。