论文部分内容阅读
目的:每年全球新增头颈部恶性肿瘤病人有50多万。近年来,头颈部恶性肿瘤发病率呈上升趋势,其中90%以上的病理类型为鳞状细胞癌。随着医学科学技术的发展,针对恶性肿瘤的诊断及治疗有了很大的进步,以手术、放疗、化疗为基础的综合治疗日趋完善,但晚期头颈部鳞状细胞癌病人治疗效果仍不佳。复发和转移是头颈部鳞状细胞癌病人预后不良的重要因素。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在恶性肿瘤转移过程中发挥重要作用。因此研究头颈部鳞状细胞癌转移机制,寻找新的治疗靶点成为提高病人预后的重点问题。研究表明,Zeste同源增强子(enhancer of zeste homologue 2,EZH2)在多种恶性肿瘤中过表达,具有调控肿瘤新生血管形成及促进肿瘤细胞迁移、侵袭的能力。EZH2能激活信号转导与转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3),使STAT3的活化形式p-STAT3表达水平上调。STAT3参与肿瘤EMT进程,能够提高血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2,KDR)的表达进而促进肿瘤新生血管形成以及肿瘤转移。有报道称,VEGFR2信号通路能激活STAT3信号通路。然而,关于在头颈部鳞状细胞癌中EZH2/STAT3/VEGFR2轴是否诱导EMT进程及其具体调控机制尚不明确。方法:本课题选用UM1和CAL27两种头颈部鳞癌细胞系,采用EZH2特异性小分子抑制剂DZNEP下调EZH2的表达,EZH2过表达质粒上调EZH2的表达,另外还使用小干扰RNA分别敲低STAT3及VEGFR2,对EZH2/STAT3/VEGFR2轴调控头颈鳞癌上皮间质转化的能力进行了体内外实验研究。实验研究分为两部分:第一部分:Western blot法检测DZNEP、EZH2过表达质粒及siSTAT3、siKDR处理后两种头颈部鳞癌细胞系UM1和CAL27中EZH2、STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGFR2及EMT相关蛋白的表达变化;细胞划痕实验检测DZNEP、siSTAT3及siKDR处理后,两种HNSCC细胞系迁移能力的改变;Transwell体外侵袭实验检测两种HNSCC细胞系迁移、侵袭能力的改变;免疫荧光技术检测DZNEP、siSTAT3及siKDR处理后两种HNSCC细胞系EMT相关指标的变化;细胞骨架染色方法检测两种HNSCC细胞系处理前后细胞骨架的改变。第二部分:应用头颈鳞癌细胞系CAL27建立免疫缺陷裸鼠皮下荷瘤动物模型,使用DZNEP瘤内注射治疗,每次注射药物前测量肿瘤大小,称量小鼠体重,密切观察肿瘤生长变化,待观察结束,剥离裸鼠荷瘤,采用免疫组织化学方法检测EZH2、STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGFR2及EMT相关蛋白表达水平变化情况,通过体内实验,进一步验证体外实验的结果。结果:与对照组相比,使用EZH2过表达质粒转染细胞后,p-STAT3、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平升高,STAT3表达水平无明显变化。使用DZNEP处理细胞降低EZH2表达后,p-STAT3、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平降低,STAT3表达水平无明显变化,EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示,N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,细胞骨架形成减少,呈现张力型骨架。使用si STAT3处理细胞降低STAT3表达后,p-STAT3、EZH2、VEGF、VEGFR2表达水平均降低,EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示,N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,骨架形成减少,呈现张力型骨架。使用siKDR处理细胞降低VEGFR2表达后,EZH2、p-STAT3、VEGF表达水平均降低,STAT3表达水平无明显变化,EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示,N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,骨架形成减少,呈现张力型骨架。荷CAL27头颈鳞癌裸鼠动物模型结果示:DZNEP药物治疗后,能够显著抑制EZH2、p-STAT3、VEGF、VEGFR2的表达,STAT3表达无明显变化,同时EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调。体内外实验结果一致。结论:头颈鳞癌细胞系中存在EZH2/STAT3/VEGFR2轴,分别抑制EZH2、STAT3及VEGFR2三者中任何一个的表达能够影响其他两个蛋白的表达,逆转EMT进程,降低头颈鳞癌细胞系的迁移、侵袭能力。用DZNEP治疗荷CAL27头颈鳞癌裸鼠后,能下调p-STAT3及VEGFR2的表达,抑制EMT进程;EZH2/STAT3/VEGFR2网络可能成为治疗头颈部鳞状细胞癌新的靶点。