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铝毒是酸性土壤中限制植物生长的主要因素之一,有机酸分泌在植物耐铝机制中发挥着重要作用。最近的研究发现低磷胁迫和铝胁迫均可诱导植物中某些14-3-3和质膜H+-ATPase异构型基因的表达。同时,植物根尖质膜H+-ATPase活性与根系柠檬酸的分泌有关,质膜H+-ATPase可能通过一个柠檬酸-质子转运体系参与柠檬酸分泌过程的调控,并且14-3-3蛋白能够参与质膜H+-ATPase活性的调控。在铝处理液中添加质膜H+-ATPase的激活剂(FC)或抑制剂(AMP),增加或降低质膜H+-ATPase活性的同时,柠檬酸的分泌也随之增加或降低。因此,通过改变质膜H+-ATPase活性调控有机酸分泌可能是独立于有机酸通道蛋白调控的另一个重要机制。本研究以铝耐受型黑大豆RB和铝敏感型黑大豆SB为实验材料,从分子水平上考察研究了黑大豆14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase表达与互作响应铝胁迫应答机制。主要得到以下结果：1.在水培条件下研究50μM铝胁迫对RB和SB根尖14-3-3基因(SGFl4)的转录、翻译及14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase相互作用的影响。结果显示铝胁迫显著诱导RB根尖14-3-3a (SGF14a)亚型基因的表达,而对SB中14-3-3a基因的表达有抑制作用；铝胁迫也诱导RB和SB中质膜H+-ATPase基因(GHA2)的表达,但在RB中的表达量明显高于SB。免疫共沉淀(Co-IP)和Western blot分析结果显示铝胁迫诱导RB质膜H+-ATPase的磷酸化,促进14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合呈现时间依赖模式；而在SB中质膜H+-ATPase磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合都呈现下降趋势。与此结果相一致,在50μM铝胁迫期间,RB根尖质膜H+-ATPase的活性和H+泵活性及柠檬酸的分泌均表现上升趋势,而SB根尖质膜H+-ATPase的活性和H+泵活性及柠檬酸的分泌均表现下降趋势。这说明铝胁迫诱导RB根尖质膜H+-ATPase的磷酸化,并且促进14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合,从而增加其质膜H+-ATPase的活性和H+泵活性并增强其柠檬酸的分泌,而在SB根中铝胁迫减少质膜H+-ATPase的磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合,从降低其质膜H+-ATPase的活性和H+泵活性及其柠檬酸的分泌,这可能是RB耐铝能力强于SB的一个重要原因。2.FC(壳梭孢素)通过促进14-3-3蛋白与磷酸化的质膜H+-ATPase结合而增加质膜H+-ATPase的活性：而AMP是14-3-3蛋白和磷酸化质膜H+-ATPase结合的抑制剂,具有抑制质膜H+-ATPase活性的作用。通过FC处理SB、AMP处理RB来改变14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的相互作用,验证铝胁迫下二者的相互作用是否参与黑大豆柠檬酸分泌及铝耐受性的调控作用。根相对生长率(RRG)的分析结果显示在50μM铝胁迫下,添加1μM FC处理8h能够显著缓解铝胁迫对SB根生长的抑制(RRG增加36.4%),而添加100μM AMP处理8h显著降低RB对铝胁迫的耐受性(RRG减少41.4%)；免疫共沉淀分析显示铝胁迫下FC的存在增强SB根中14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合,根尖质膜H+-ATPase活性提高约1倍,根氢泵活性和质子外排能力显著增强,根尖柠檬酸的分泌量显著增加(约2倍)。而AMP的存在降低RB根中14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的相互作用,使根尖质膜H+-ATPase活性降低约1倍,根氢泵活性和排氢能力显著降低,使根柠檬酸的分泌量减少约1倍。这些结果证实14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的互作参与铝胁迫下黑大豆柠檬酸分泌的调控,改变二者的互作水平可以改变黑大豆对铝胁迫的耐受性。3.烟草因为植株个体较大容易繁殖和转化,是植物学领域研究广泛应用的模式植物之一。为了利用转基因烟草验证黑大豆14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase应答铝胁迫的分子机制,本研究考察野生型(WT)烟草14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase(PMA)应答铝胁迫的分子机制。结果说明WT烟草对铝胁迫较敏感,50μM铝胁迫逐渐降低14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的表达水平并减少它们之间的相互作用,及降低WT烟草根的H+和柠檬酸的分泌。在铝胁迫下添加FC可以增加WT烟草PMA的活性和柠檬酸的分泌及烟草对铝的耐受性,而添加AMP则获得相反的结果。这些结果说明WT烟草根中14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的表达与互作和PMA的活性及柠檬酸的分泌有关,证实WT烟草根中14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase应答铝胁迫的分子机制与铝敏感黑大豆SB相似。4.为了进一步验证铝胁迫诱导RB的14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的表达与互作在调控柠檬酸分泌和植物耐铝能力中的作用,在转基因中烟草中分别过量表达SGF14a和没有C末端自抑制域的△GHA2,同时利用RNAi干扰技术获得烟草14-3-3e基因和质膜H+-ATPase (pma4)基因抑制表达的转基因烟草株系。进一步分析结果表明在烟草中过量表达SGF14a产生大量的14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase结合,维持质膜H+-ATPase磷酸化水平的稳定性,这不仅能够增强质膜H+-ATPase的活性和H+的分泌作用,并且还能够拮抗铝和抑制剂AMP对其活性的抑制,增加烟草根尖柠檬酸的分泌量,显著降低铝胁迫下烟草根内H202的积累和氧化胁迫的程度,增强烟草的耐铝能力及其适应红壤中低磷胁迫的能力：而在烟草中抑制14-3-3蛋白的表达时,磷酸化的质膜H+-ATPase因缺乏14-3-3蛋白结合,使其磷酸化状态不稳定而发生了脱磷酸化作用,从而降低转基因烟草根尖质膜H+-ATPase的活性和柠檬酸的分泌量,降低转基因烟草的耐铝能力和适应低磷胁迫的能力。当在烟草中过量表达4GHA2基因时对转基因烟草根尖14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的相互作用及其磷酸化水平没有影响,但显著提高转基因烟草根中质膜H+-ATPase的活性和根尖柠檬酸的分泌量及其耐铝能力,在红壤上的生长情况好于野生型烟草；而抑制质膜H+-ATPase (pma)的基因表达显著减少转基因烟草根尖与14-3-3蛋白结合的磷酸化质膜H+-ATPase,同时也显著降低烟草根尖质膜H+-ATPase的活性和H+分泌能力及柠檬酸的分泌作用,增加铝胁迫下烟草根内H202的积累,降低烟草对铝胁迫的耐受性和适应低磷胁迫能力。本研究结果为利用基因工程和分子生物学手段来提高植物耐铝能力提供了新的策略和基因资源。