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第一部分成体SD大鼠NSCs的分离、培养、传代、分化与鉴定
【目的】成体SD大鼠海马细胞分离、纯化、体外培养，进行神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的鉴定及增殖、分化能力的检测。
【方法】采用机械方法分离、消化SD大鼠海马细胞，用含有EGF和bFGF的培养液进行体外培养。MTT法绘制细胞生长曲线；Brdu检测细胞增殖状态；免疫荧光检测Nestin表达和诱导分化形成神经元的标记NSE及星型胶质细胞的标记GFAP的荧光表达。
【结果】原代细胞和传代细胞培养均能形成较大及较多的克隆球；传代细胞于四代左右时有大量增殖；单克隆培养传代至8代以后增殖状态明显退化；原代、传代以及单克隆培养细胞均表达Nestin阳性；诱导分化后细胞能够分化为表达NSE和GFAP的阳性细胞即神经元和星型胶质细胞。
【结论】体外培养成体SD大鼠海马细胞具有自我增殖能力及多分化潜能。体外培养纯化法可以成功培养成体SD大鼠神经干细胞。
第二部分Brca-1基因调控NSCs增殖的实验研究
【目的】观察雌激素干预Brca-1基因表达后，体外培养神经干细胞增殖的变化情况，初步探讨Brca-1基因对神经干细胞增殖的影响。
【方法】成体SD大鼠神经干细胞体外培养后，应用不同浓度的雌激素(10<-5>、10<-6>、10<-7>、10<-8>、10<-9>)进行干预，设正常培养的神经干细胞为对照组。培养细胞随机分为6组(n=8)，分别为：对照组；10<-5>雌激素组(E1)；10<-6>雌激素组(E2)；10<-7>雌激素组(E3)；10<-8>雌激素组(E4)；10<-9>雌激素组(E5)。应用免疫荧光法在细胞培养1d、7d、14d、2ld对Nestin荧光强度和Brdu阳性细胞数进行定量分析；对培养的细胞进行诱导分化，做NSE及GFAP染色鉴定细胞分化能力。应用RT-PCR法对Brca-1mRNA进行检测；应用Western blot对Brca-1蛋白进行检测；对Brdu阳性细胞数和Brca-1mRNA表达量做相关性分析。
【结果】①各组培养的细胞均表达Nestin阳性；诱导分化后均可检测到NSE和GFAP阳性细胞。②细胞培养2ld激光共聚焦显微镜检测Nestin表达：，E1、E2、E3组Nestin表达与对照组比较明显升高(P(0.05)；E4、E5组表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。③各时间点E1、E2、E3组Brdu阳性细胞数较对照组升高(P<0.05)；E4组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；E5组细胞增殖较对照组数量减少(P＜0.05)。④E1、E2、E3组Brca-1 mRNA表达与对照组比较，均有统计学差异(P<0.05)；E4、E5组Brca-1 mRNA与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。E1、E2、E3组之间无统计学差异(P>0.05)，但是Brca-1mRNA表达量的绝对值是逐渐降低的；E1、E2、E3组与E4、E5组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。⑤E1、E2、E3组Brca-1蛋白表达与对照组比较，均有统计学差异(P<0.05)；E4、E5组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。E1、E2、E3组之间无统计学差异(P>0.05)，但是Brca-1蛋白表达量的绝对值是逐渐降低的。；E1、E2、E3组与E4、E5组有统计学差异(P(0.05)。⑥经相关性分析，Brca-1基因表达量与细胞增殖量呈正相关(r=0.46)。
【结论】①雌激素可以上调体外培养神经干细胞Brca-1mRNA表达。②Brca-1基因可能在神经干细胞的增殖中起正向调控作用。
第三部分NSCs移植治疗SD大鼠脑梗死模型的实验研究
【目的】观察神经干细胞移植对急性缺血性脑梗死模型SD大鼠影响。
【方法】48只SD大鼠随机分为4组：假手术组(sham组)；脑缺血再灌注组(CIR组)；移植正常培养NSCs组(CN组)；移植10<-5>浓度17β-雌二醇培养NSCs组(CE组)。参照Longa等线栓法建立SD大鼠急性脑梗死模型。采用立体定位法，向模型大鼠病侧脑室内注射体外培养的成体NSCs。采用动物行为学评分评价模型动物不同时间点的神经功能缺损；激光共聚焦显微镜观察神经干细胞Nestin表达；TTC染色测定不同时间点脑梗死体积变化；光镜和电镜分别观察脑梗死区病理变化。免疫组织化学检测NSE和GAFP表达。
【结果】①经NSCs移植治疗的两组动物神经功能恢复与未经细胞移植治疗组相比有统计学意义(P<0.05)；三个个治疗组中，经17.B雌二醇培养的NSCs组与正常培养的NSCs组比较有统计学意义(P<0.05)。②对照组4d时荧光强度最强，7d时基本上没有荧光表达。CN组在4d时荧光强度最强，7d时基本无荧光。其余治疗组也是在4d时表现最强，但是持续表达高强度的时间长，7d时仍有较强荧光表达。③CIR组脑梗死体积变化不大，CN组脑梗死体积缩小，与CIR组比较有统计学差异(P<0.05)。CE治疗组脑梗死体积明显显缩小，与其它两组相比有统计学意义(P<0.05)。④经雌激素调控的细胞移植治疗7d神经元基本元肿胀，核仁清晰，染色质分布正常，大部分毛细血管形态正常；正常培养的神经干细胞移植后治疗效果好于对照组和假手术组；雌激素调控的神经干细胞治疗效果好于正常培养的神经干细胞。⑤经雌激素培养的NSCs治疗组表达的阳性结果也高于未经雌激素培养的NSCs组。统计学处理有统计学差异。NSE和GFAP的表达有逐渐增强的趋势。以经17 β—雌二醇10<-5>培养的细胞治疗组为最高。
【结论】①NSCs移植治疗脑梗死模型动物，可以改善其神经功能缺损。②用雌激素上调Brca-1基因表达的NSCs移植后治疗效果好于正常培养的NSCs。