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目的:构建pGC-SPAG6-shRNA重组慢病毒载体在MDS细胞株中靶向抑制精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,SPAG6)基因的表达,探索SPAG6基因沉默对SKM-1细胞自噬的影响及可能的分子机制,并初步探讨在SKM-1细胞中细胞自噬与细胞凋亡之间的关系。方法:1.筛选慢病毒靶向沉默SPAG6基因表达的最佳序列并构建SPAG6-/-型稳定感染的SKM-1细胞株模型:体外培养SKM-1细胞分别感染阴性对照慢病毒载体(NC-shRNA)和靶向抑制SPAG6基因表达慢病毒载体(SPAG6-shRNA),荧光倒置显微镜观察SKM-1细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,0.5μg/ml嘌呤霉素筛选稳定感染的SKM-1细胞株2周,并用流式细胞仪检测慢病毒感染效率;qRT-PCR和Western blot法验证SPAG6基因的干扰效果。2.探索SPAG6基因沉默对SKM-1细胞自噬和凋亡的影响:qRT-PCR检测NC-shRNA和SPAG6-shRNA两组细胞内自噬相关基因mRNA的表达水平;透射电子显微镜(TEM)检测自噬小体的表达情况;Western blot法检测自噬及凋亡相关蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡情况。3.探索SKM-1细胞中细胞自噬与凋亡之间的关系:细胞分为NC-shRNA组,SPAG6-shRNA组,SPAG6-shRNA联合3-MA处理组,SPAG6-shRNA联合CQ处理组。透射电子显微镜(TEM)检测各组细胞内自噬小体的表达情况;Western blot法检测自噬及凋亡相关蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡情况。4.探索SPAG6基因在SKM-1细胞中调控细胞自噬可能的分子机制:细胞分为NC-shRNA组,SPAG6-shRNA组,NC-shRNA联合Compound C处理组,SPAG6-shRNA联合Compound C处理组。Western blot法检测AMPK/mTOR/ULK1通路蛋白及自噬和凋亡相关蛋白的表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:1.成功筛选出慢病毒靶向沉默SPAG6基因表达的最佳序列并构建出SPAG6-/-型稳定感染的SKM-1细胞株模型:荧光倒置显微镜下观察到SKM-1细胞中绿色荧光蛋白(GFP)大量表达,流式细胞术检测示SKM-1细胞的慢病毒感染效率均在80%以上,qRT-PCR和Western blot结果显示SPAG6基因的mRNA和蛋白表达水平明显受到抑制。2.沉默SPAG6基因表达可诱导SKM-1细胞发生自噬和凋亡。qRT-PCR结果显示,与NC-shRNA组相比,SPAG6-shRNA组中LC3-Ⅱ、Beclin-1、ATG-5、ATG-7等自噬相关基因mRNA的表达水平增加;TEM观察发现,与NC-shRNA组相比,SPAG6-shRNA组自噬小体的表达增加;Western blot结果显示,与NC-shRNA组相比,SPAG6-shRNA组中ATG-5、ATG-7、LC3-Ⅱ、Beclin-1、cleaved caspase-3及Bax的水平增加,而P62和Bcl-2表达降低;流式细胞术结果显示,与NC-shRNA组相比,SPAG6-shRNA组细胞凋亡明显增加。3.自噬抑制剂(3-MA和CQ)抑制自噬可减弱SPAG6基因沉默诱导的细胞凋亡。使用自噬抑制剂(3-AM和CQ)联合SPAG6-shRNA共同处理SKM-1细胞后,Western blot结果显示,与SPAG6-shRNA单独处理组相比,SPAG6-shRNA联合3-MA/CQ处理组Bcl-2的表达水平增加,Bax和cleaved caspase-3的表达水平降低。流式细胞术结果显示,与SPAG6-shRNA单独处理组相比,SPAG6-shRNA组联合3-MA/CQ处理组细胞凋亡明显减少。4.SPAG6通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路调控SKM-1细胞自噬。Western blot结果显示,与NC-shRNA组相比,SPAG6-shRNA组中p-AMPK、p-ULK1的表达水平增加,而p-mTOR的表达水平降低,两组之间AMPK、mTOR、ULK1的总蛋白表达无明显差异。使用AMPK抑制剂(Compound C)联合SPAG6-shRNA共同处理SKM-1细胞后发现,与单独SPAG6-shRNA组相比,SPAG6-shRNA联合Compound C共同处理组LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平降低,而P62的表达水平增加;伴随着Bax和cleaved caspase-3的表达水平降低,而Bcl-2的表达增加。流式细胞术结果显示,与SPAG6-shRNA单独处理组相比,SPAG6-shRNA组联合Compound C处理组细胞凋亡相对减少。结论:沉默SPAG6基因可能通过活化AMPK/mTOR/ULK1信号通路诱导SKM-1细胞发生自噬并进一步增加细胞凋亡。SPAG6基因可能是MDS治疗的潜在靶标,自噬是其发挥作用的重要机制。