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目的探讨弓形虫排泄分泌抗原(ESAs)对神经干细胞分化的影响及其机制。方法(1)分别用含5%马血清、10%胎牛血清的DMEM完全培养液,无血清DMEM培养液及含2%N2的DMEM/F12培养液培养诱导神经干细胞系C17.2分化,逐日观察细胞形态变化,并于诱导分化后第1d、3d、5 d收集细胞,提取RNA,采用RT-PCR检测神经元标志蛋白βⅢ-tubulin基因的转录水平。(2)用含ESAs的2%N2DMEM/F12培养液培养C17.2细胞5 d,免疫荧光检测神经元特异性标记物βⅢ-tubulin和神经胶质细胞特异性标志物GFAP的表达,Western blotting检测βⅢ-tubulin蛋白水平。(3)2%N2+DMEM/F12培养液诱导C17.2细胞分化,用三种不同剂量的ESAs(0.07mg/ml、0.14mg/ml和0.28mg/ml)干预后5 d,收集细胞,提取总蛋白,采用Western blotting检测βⅢ-tubulin、GFAP蛋白水平。(4)Wnt通路激活剂Wnt3a预处理C17.2细胞后诱导分化,Western blotting法检测Wnt3a预处理组及ESAs干预组Wnt通路中相关蛋白β-catenin(胞浆和胞核)、Ngn1和Ngn2的表达水平。结果(1)用含2%N2的DMEM/F12培养液培养C17.2细胞5 d:C17.2细胞见大量密集长轴突,βⅢ-tubulin基因转录水平为3.93±0.13;完全培养液组无明显轴突,βⅢ-tubulin基因转录水平为0.08±0.34%;无血清DMEM培养液组见极少量稀疏长轴突,βⅢ-tubulin基因转录水平为0,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)C17.2细胞在诱导分化后5d,免疫荧光检测结果显示ESAs干预组神经元标记蛋白βⅢ-tubulin和神经胶质细胞标记蛋白GFAP的荧光信号较诱导分化组明显减弱;Western blotting检测结果显示ESAs干预组的βⅢ-tubulin蛋白水平为0.015±0.003,明显低于2%N2诱导分化组(0.107±0.012)(P<0.05)。(3)经不同剂量ESAs(0.07mg/ml、0.14mg/ml、0.28mg/ml 3种不同剂量)干预培养C17.2细胞5 d,βⅢ-tubulin的相对表达量分别为0.617±0.058,0.290±0.072,0.043±0.006,2%N2诱导分化对照组为1.507±0.092;GFAP的相对表达量分别为0.069±0.06,0.040±0.003,0.029±0.004,2%N2诱导分化对照组为0.704±0.036。说明ESAs抑制神经干细胞分化,随着剂量的增加抑制作用更明显,呈剂量依赖性。(4)ESAs干预组、Wnt3a预处理组和Wnt3a预处理+ESAs干预组三组在细胞培养5d后检测到核内β-catenin相对表达量分别为0.033±0.006,0.140±0.026,0.081±0.003,且后两组组间差异具有统计学意义(P<0.05),胞浆内β-catenin的表达也是经Wnt3a预处理的ESAs干预组(0.034±0.01)低于Wnt3a预处理组(0.041±0.01)。另外,β-catenin下游的靶基因Neurogenin(Ngn)1和2的表达量在经Wnt3a预处理的ESAs干预组(分别为1.603±0.451和0.069±0.035)明显低于Wnt3a预处理组(分别为2.507±0.060和0.117±0.011),差异具有统计学意义,表明ESAs削弱了Wnt通路激活剂Wnt3a的激活作用,并干扰了神经干细胞的分化。结论(1)弓形虫可通过其排泄分泌抗原(ESAs)抑制C17.2神经干细胞分化,且抑制水平呈现剂量依赖性。(2)弓形虫排泄分泌抗原(ESAs)可显著降低Wnt/β-catenin通路中的关键分子β-catenin的表达水平,以及下游靶基因Ngn1和Ngn2的表达,推测其可能通过此信号通路干预C17.2神经干细胞分化。