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目的:通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)技术建立敲除TET1(ten-eleven translocation 1)的Hela细胞株,研究TET1对Hela细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤能力的影响。方法:采用CRISPR/Cas9技术构建TET1敲除的Hela细胞株作为敲除组:先设计两条单链oligo DNA,再将单链合成双链dsDNA并与pGK1.2质粒进行连接,脂质体化学转染法将该质粒转染到Hela细胞中,再提取Hela细胞的DNA检测TET1敲除效率,最后将它们送生工做DNA测序同时提取Hela细胞蛋白,采用Western blot方法检测TET1蛋白表达;采用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA,Real Time Cellular Analysis)研究敲除组和野生组Hela细胞增殖能力,在xCELLigence RTCA S16系统上接种等量的各组细胞培养90 h(n=8),分析各组细胞的CI值(Cell Index,CI值);采用划痕实验研究敲除组和野生组Hela细胞迁移能力,在六孔板中接种等量的各组细胞培养24h后(n=3),在每孔细胞中制造划痕,观察各组细胞迁移情况,计算细胞划痕愈合率;运用Transwell小室(Transwell chamber,Transwell insert)侵袭模型模拟体外实验研究敲除组和野生组Hela细胞的侵袭能力,在Transwell小室中加入等量的各组细胞培养24h和48h后(n=3),分别计算各组细胞的穿膜细胞数量;运用裸鼠成瘤实验研究敲除组和野生组Hela细胞的体内成瘤能力,在裸鼠腹股沟皮下注射等量的各组细胞(n=3),6周后取出肿瘤计算大小;统计学方法:采用SPSS13.0统计软件,计量资料以±s表示,比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:Case9载体合成后,结果发现只有TET1(cas9)-2F/2R在100bp处有条带,将其质粒进行扩增;将该质粒转染Hela细胞后发现,转染空白质粒的Hela细胞无荧光反应,而转染了TET1-gRNA质粒的Hela细胞随着时间的推移,呈现绿色荧光反应的细胞越来越多,表明TET1-gRNA质粒转染Hela细胞成功;选取两孔转染TET1-gRNA质粒的Hela细胞(1号和2号)及野生型Hela细胞作为对照组,提取基因组DNA,采用T7E1酶切验证,结果切割效率分别为54%和30%;各组细胞Western blot检测结果发现,野生组Hela细胞正常表达TET1蛋白,而敲除TET1组的细胞蛋白表达水平明显下调或缺失;基因测序结果也证明我们成功获取TET1基因敲除的单克隆Hela细胞株;TET1敲除组和野生组Hela细胞90h CI值分别为1.04±0.86、1.57±1.01,结果发现TET1敲除组细胞CI值大于野生组Hela细胞(P<0.05);敲除组HeLa细胞24h和48h的迁移率分别为29±4%和51±7%,而野生型组HeLa细胞的迁移率分别为19±4%和31±4%,结果发现TET1敲除组的迁移率均明显大于野生组Hela细胞(P<0.05);敲除组HeLa细胞24h和48h的穿过transwell小室的细胞数分别为158±6和206±12个,而野生型组HeLa细胞的侵袭率为109±4和142±7个,结果发现TET1敲除组的穿膜细胞数均明显大于野生组Hela细胞(P<0.05);敲除组HeLa细胞在小鼠体内形成的肿瘤大小为362±41 mm3,而野生型组HeLa细胞为215±23 mm3,结果发现TET1敲除组在小鼠体内形成的肿瘤大小均明显大于野生组Hela细胞(P<0.05)。结论:采用CRISPR/Cas9技术成功构建TET1敲除的宫颈癌Hela细胞株;TET1敲除组细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤能力大于野生组Hela细胞,TET1低表达可能增强Hela细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤能力。