一、研究背景斑点热群立克次体（Spotted fever group rickettsia,SFGR）是立克次体属,短小棒状,革兰氏阴性细胞内寄生菌,主要经蜱传播,导致人兽共患自然疫源性疾病-斑点热群立克次病。在2012年以前,我国大陆共发现了9种斑点热群立克次体,2012年,本课题组在黑龙江省发现了一种新的立克次体病,新塔拉塞维奇立克次体病（Candidatus Rickettsia tarasevichiae,CRT）,临床表现不同于立克次体引起的常见症状,未出现红斑,表现为淋巴结肿痛和叮咬处焦痂。在持续的监测中又发现了西伯利亚立克次体BJ-90亚种（Rickettsia sibirica sp BJ-90）,可以引起病人多器官功能损害。随后又发现了拉欧蒂立克次体病（Rickettsia raoultii,R.raoultii）,症状较轻。最近,我国学者又在蜱中陆续发现多种新发立克次体,如图兰扇头蜱中的Rickettsia aeschimannii,Rickettsia massiliae,青海血蜱中的Candidatus Rickettsia gannanii,以及Candidatus Rickettsia barbariae、Rickettsia sp.Tselentii等。这些新发立克次体是否对人致病尚不明确,新发立克次体的不断出现,警示我们必须坚持对立克次体的持续监测。立克次体的分布及传播与媒介蜱的地理分布有关,但起主导作用的是立克次体与媒介蜱的互相选择作用,研究证实立克次体可在媒介蜱的不同发育阶段有效传播并且维持其致病性,是取决于蜱对立克次体的选择压力（Selective Pressure）,主动选择了毒性较弱或有利于媒介蜱的病原体在其体内维持,不同立克次体在媒介蜱体内的易感性不同,其对蜱虫的影响也不尽相同。媒介蜱体内的微生物相互作用可直接影响病原体的特性以及传播动力学,蜱虫体内微生物多样性与多种因素有关,包括不同环境下饲养的蜱、蜱的不同虫态、蜕皮时间长短、吸血时间长短以及表面携带菌差异,研究新发立克次体与媒介蜱微生物菌群之间的关系有助于对蜱传立克次体病的风险预测,评价其流行趋势,也是立克次体研究的崭新领域。本研究中两种新发立克次体的感染是否会影响媒介蜱的生殖发育?新发立克次体在媒介蜱中经卵经期传播规律与趋势以及立克次体在媒介蜱体内的传播规律与蜱自身携带的微生物菌群之间的关系是目前亟待解决的科学问题。二、研究目的（1）阐明两种新发立克次体对媒介蜱生长发育的影响（2）明确实验室条件下两种新发立克次体在媒介蜱体内经期、经卵传播变化规律（3）了解两种媒介蜱微生物菌群多样性与新发立克次体垂直传播之间的关系三、实验方法本研究选择BALB/c小鼠和新西兰大白兔对全沟硬蜱和森林革蜱进行饲喂,采用PCR结合测序对全沟硬蜱和森林革蜱携带的新发立克次体进行确认,荧光定量PCR检测不同虫态立克次体的载量,运用2^-ΔΔCt法计算不同虫态相对于对照组的差异倍数,描述其经期经卵传播趋势。通过16S rRNA V3-V4高变区扩增子测序对两种媒介蜱不同虫态携带菌群情况进行分析,比较分析立克次体感染与否与媒介蜱生物学特性及其菌群之间的关联特性及其差异。四、研究结果采集全沟硬蜱300只,森林革蜱60只,通过实验室饲养获得80只饱血全沟硬蜱,其中35%感染CRT,获得48只饱血森林革蜱,其中Rickettsia raoultii的感染率为12.5%。通过对立克次体阴性组和阳性的发育指标进行计算发现,CRT阳性组的卵孵化率高于阴性组的孵化率（阳性组孵化率为66.8%,阴性组孵化率为49.8%,P<0.05）,且差异具有统计学意义,生活周期无差异,其他发育指数无差异;获得18组CRT感染的全沟硬蜱种群5个虫态的平均立克次体相对载量,以一代饱血母蜱作为参照,经产卵阶段、幼蜱、若蜱、二代成蜱中的立克次体平均变化倍数分别为0.44、1.40、5.77、17.99,可见CRT经全沟硬蜱的不同发育阶段总体规律为经卵传播立克次体载量降低,经期传播过程中立克次体载量升高,且发育至成蜱时,明显高于第一代的母蜱。获得6组Rickettsia raoultii感染的森林革蜱种群5个虫态的平均立克次体相对载量,以一代饱血母蜱为参照,经产卵、幼蜱、若蜱、二代成蜱中的立克次体平均变化倍数分别为0.03、0.12、0.15、0.42,即Rickettsia raoultii在森林革蜱体内经卵经期传播过程中,总体变化规律也为先降低后升高,但是经过一代的繁殖,立克次体的载量低于第一代的载量;通过物种注释,全沟硬蜱立克次体阳性组获得的共有OTU数（共有OTU数为1086个）和特有OTU数均高于阴性组（共有OTU数为259）,两组内OTU数变化趋势相同,均为随着母蜱产卵过程,OTU数降低,后随幼蜱吸血蜕皮以及若蜱吸血蜕皮过程OTU数逐渐升高,可以看出吸血过程引起蜱内微生物菌群丰富度升高,在立克次体阳性组中相对于阴性组存在显著差异的细菌属分别为立克次体属、肠杆菌属、螺旋体属、苍白杆菌属、葡萄球菌属、谷氨酸杆菌属。从森林革蜱物种注释结果来看,阳性组的共有OTU数为308个低于阴性组的OTU数565个,但是通过吸血蜕皮完成一代繁殖,阳性组二代成蜱的OTU数高于阴性组OTU数,提示立克次体促进了某些菌群的繁殖,阳性组存在差异显著的菌分别为立克次体属、葡萄球菌属、杀雄菌属、枯杆菌属、短杆菌属。五、研究结论明确了CRT可在全沟硬蜱的发育过程中对孵化率产生积极地作用,即促进了孵化过程。揭示了两种新发立克次体在媒介蜱经卵经期传播规律,经卵立克次体载量降低,经期立克次体载量升高。且CRT经卵经期传播后显著高于第一代蜱,揭示了全沟硬蜱为该立克次体的优势媒介。Rickettsia raoultii经卵经期传播后低于第一代立克次体载量。通过微生物种群多样性分析找到组间差异较大的菌群,分析病原体与微生物之间的互惠互利作用及选择作用。六、意义与创新性新发斑点热群立克次体病日益成为全球性重要的公共卫生问题,对人类健康存在潜在威胁。本研究从传播媒介切入,通过现场获得天然感染蜱,结合实验室饲养观察以及现代分子生物学技术,明确了两种新发立克次体对媒介蜱生活史及发育指标的影响,阐述了两种新发斑点热群立克次体在媒介蜱不同发育阶段的传播规律,通过16S rRNA V3-V4高变区扩增子测序,获得蜱虫不同发育阶段微生物菌群的变化以及立克次体与微生物菌群之间的关系,为新发斑点热群立克次体感染流行的防控提供新的思路和策略。