磷脂混杂酶1和中期因子在原发性肝细胞癌发生发展中作用的研究

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目的:通过检测PLSCR1与MK在肝癌组织及癌旁肝正常组织中的基因表达差异并分析PLSCR1与MK和肝癌病理特征的相关性及两者之间的相关性,并运用Cox回归模型分析临床基础资料对患者总生存期的影响;构建重组质粒,在细胞水平探讨PLSCR1与MK相互作用在肝癌发生发展中可能的作用机制。方法:1)收集我院2009年1月至2013年6月期间收治的原发性肝细胞癌手术切除患者肝癌组织和对应癌旁肝正常组织标本各40例,所有病例确诊为原发性肝细胞癌,所有病例均为初诊,术前均未接受过放化疗、中医及免疫治疗,临床资料完整。每例标本均留取肿癌组织和癌旁正常肝组织。手术标本切除后于30min内取样本并液氮速冻,保存于-80℃冰箱备用。采用Real-Time PCR技术(Q-PCR)检测40例肝癌组织与癌旁正常组织中PLSCR1与MK表达量,统计分析其与患者临床病理特征关系,采用Cox回归模型分析临床基础资料对患者总预后生存期的影响以及分析PLSCR1和MK表达水平之间的相关性。2)根据质粒pET28a(+)-PLSCR1、pGEX-4T1-MK、pcDNA3.1/myc-His(-)A-PLSCR1 和 pcDNA3.1-MK 设计引物,构建质粒;然后将测序确认的重组质粒pET28a(+)-PLSCR1和pGEX-4T1-MK重组表达质粒分别转入BL21菌株中,分别将上述重组表达质粒转化菌株中加入IPTG进行诱导表达,利用GST-pull down技术和免疫共沉淀(CO-IP)技术验证PLSCR1与相互作用蛋白MK之间的相互作用。3)研究PLSCR1和MK相互作用对肝癌细胞增殖的影响。分别构建PLSCR1和MK的siRNA干扰质粒,分组转染 HepG2 细胞:MK-siRNA 组,PLSCR1-siRNA 组,MK+PLSCR1-siRNA 共转组和未加任何处理的对照组,借助酶联免疫检测仪测定并记录各孔在450nm波长下对应的吸收值。4)检测PLSCR1和MK相互作用对肝癌细胞迁移的影响:将MK-si-RNA-HepG2,PLSCR1-siRNA-HepG2 细胞、MK+PLSCR1-siRNA-HepG2 细胞、Control-siRNA-HepG2细胞及HepG2细胞接种于小室内,培养48h后进行细胞染色,通过普通倒置显微镜下对细胞的迁移情况进行观察,在560nm下测定细胞裂解液的吸收值,并定量计算其含量。结果:1)肝癌组织中PLSCR1和MK基因的表达量明显高于癌旁组织,PLSCR1的 A△Ct 值分别为-2.36+1.49,2-△△Ct值(RQ 值)均值为 8.55±7.67;MK 的 △△Ct值为-2.97±0.86,RQ值为9.05±3.97,具有差异有统计学意义(P<0.05)。依据40例患者RQ值均值将PLSCR1和MK进行分组,RQ值≥10为高表达组,RQ值<10为低表达组进行分析,结果表明PLSCR1与MK的表达与患者的年龄、是否伴随肝硬化、血液AFP值、肿瘤大小及是否包膜侵犯无关(P>0.05),而与患者的性别、肿瘤分化程度、肿瘤数目、血管浸润及临床分期相关性显著(P<0.05)。2)我们通过Kaplan-meier生存分析PLSCR1和MK的癌/癌旁组织的倍数变化(RQ值)对肝癌术后总生存期的影响,发现PLSCR1和MK高表达组的生存率明显低于低表达组,Breslow法检验水平间的两两比较具有显著性差异(P<0.05)。运用Cox回归模型分析患者临床基础资料及患者PLSCR1和MK基因的表达量与肝癌术后生存期相关风险因素,发现包膜侵犯、血管浸润、Ki-67值、性别、肝硬化及PLSCR1和MK高表达是评估总生存期的风险因素(P<0.05),包膜侵犯风险系数最高为8.04(P=0.001);肝癌组织中PLSCR1和MK表达水平Spearman相关性分析结果显示r=0.30(P=0.03),两者存在弱正相关性。3)对成功构建的质粒进行酶切鉴定,测序结果表明,构建四个质粒的外源片段按正确的阅读框架连入pET28a(+)、pGEX-4T1、pcDNA3.1/myc-His(-)A和pcDNA3.1载体,阳性克隆经测序无误的抽提质粒;融合蛋白、蛋白沉降分析及CO-IP试验结果显示,PLSCR1和MK蛋白可以发生相互作用。4)成功构建MK和PLSCR1干扰细胞株,通过转染细胞干扰PLSCR1和MK的表达后,用CCK-8检测HepG2细胞的增殖情况,HepG2细胞的增殖效率显著降低,并同时干扰PLSCR1和MK对HepG2细胞增殖抑制作用更为显著(P<0.01);PLSCR1和MK相互作用同样对HepG2细胞迁移具有抑制作用,侵移实验表明干扰PLSCR1可以明显影响HepG2细胞的迁移作用,并且同时干扰PLSCR1和MK对HepG2细胞的迁移抑制作用更显著(P<0.01)。结论:1)PLSCR1与MK在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,其表达水平与患者临床病理特征相关性表明与患者的性别、肿瘤分化程度、肿瘤数目、血管浸润及临床分期相关性显著(P<0.05)。2)Cox回归模型分析患者临床基础资料及患者PLSCR1和MK基因的表达量与肝癌术后生存期相关风险因素,发现包膜侵犯、血管浸润、Ki-67值、性别、肝硬化及PLSCR1和MK高表达是评估总生存期的风险因素(P<0.05);肝癌组织中PLSCR1和MK表达水平Spearman相关性分析两者存在正相关性(P<0.05)。3)融合蛋白、蛋白沉降分析、CO-IP实验及GST-Pulldown实验结果表明,PLSCR1和MK蛋白可以发生相互作用。4)PLSCR1与MK蛋白相互作用影响HepG2细胞增殖和迁移,干扰PLSCR1可抑制HepG2细胞的增殖和迁移效果,同时干扰PLSCR1和MK对HepG2细胞的增殖和迁移的抑制作用更为显著(P<0.01)。
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