慢性髓性白血病树突状细胞疫苗介导的特异性抗白血病作用的研究

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慢性髓性白血病(CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。迄今为止治愈的措施仍然有限。众多的资料表明,宿主的免疫系统在识别排斥肿瘤方面起着非常重要的作用。对于肿瘤的治疗,人们越来越多地聚焦于调节机体免疫或探索有效的免疫成分来排除肿瘤。大量的临床及实验室证据表明,CML细胞具有免疫原性,能成为抗白血病细胞免疫的靶子。近10年来,人们发现CML患者体内存在识别自身肿瘤的T淋巴细胞,但是由于抗原提呈细胞的数量及功能异常等原因,造成了肿瘤特异性T细胞无应答。树突状细胞(DC)是体内抗原提呈功能最强的细胞,其最大的特点是能显著刺激初始型T淋巴细胞增殖,是机体免疫反应的始动者,DC在调控抗肿瘤、抗感染、自身免疫及移植免疫中起着重要作用,特别在抗肿瘤免疫中具有其它APC所不能相比的作用。目前认为有效的肿瘤免疫治疗途径必须能在共刺激信号的参与下,将MHC限制性的肿瘤抗原多肽提呈给T细胞,由此激发T细胞免疫应答。DC能持续高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7和ICAM-1等免疫应答相关分子,通过MHC-Ⅱ、MHC-Ⅰ分别将其限制性的肿瘤抗原提呈给CD4+和CD8+细胞,在体外和体内皆具有激发初次及继发性抗肿瘤免疫的功能。在肿瘤的免疫治疗中占有重要的地位,是当今肿瘤学领域研究的热点。目前,国内外多位学者用不同的细胞因子组合在体外成功诱导出具有刺激自身肿瘤特异性树突状细胞,这就使过继免疫治疗成为可能。本课题探讨不同细胞因子组合体外诱导慢性髓性白血病(CML)细胞分化为树突状细胞(DC)可行性及其诱导激活自体白血病细胞特异性淋巴细胞免疫应答机制的研究,旨在为进一步临床应用奠定基础。不同细胞因子体外诱导慢性髓性白血病细胞分化为树突状细胞 <WP=6>12例 CML慢性期患者初诊高白细胞时,从骨髓分离获得单个核细胞,分别在GM-CSF+IL-4、GM-CSF+IL-4+IFN-α或GM-CSF+IFN-α三种细胞因子组合的干细胞培养液(无血清培养基)中培养,培养第四天,加入TNF-α促使DC成熟。动态观察细胞形态及测定DC表型,RT-PCR检测融合基因,染色体R显带技术检测ph1染色体。同时,以8名健康志愿者作为正常对照。结果不同细胞因子组合对DC形态影响不大。刚分离的CML患者BMMNC细胞呈球形散在分布,表面光滑,经过一短暂的细胞衰减,于培养3天后,细胞开始增殖,形态变得不规则,同时悬浮细胞增多, 随着时间的延长, 异形突起明显。第7天时, 细胞均匀分布在培养液中, 细胞体积较大,可见树突状突起,离心涂片染色示典型的DC形态。免疫表型及遗传学分析结果显示培养7天的DC 染色体R显带技术显示仍具有ph1染色体异常,含IFN-α细胞因子组合诱导分化的具有ph1染色体异常核型的DC明显减少,RT-PCR检测仍示bcr/abl(+)。刚分离的CML患者BMMNC细胞,培养前HLA-A,B,C、HLA-DR分子,协同刺激分子CD80以及DC表面成熟标志CD83的表达均低,经不同细胞因子组合诱导培养后,这些膜表面分子表达均上调,与正常志愿者培养而来的DC膜表面分子的表达无明显差异,三组不同细胞因子组合膜表面分子表达亦无明显差异。CML-DC诱导激活自体白血病细胞特异性淋巴细胞免疫应答机制将以上三组不同细胞因子组合培养得来的DC,按1:5的比例,分别加入经刀豆素A(ConA)和IL-2刺激培养7天后的自体淋巴细胞中,在含有IL-2的干细胞培养液中共孵育3天。分别在共孵育的第1天及第3天收集培养上清,用ELISA法检测上清中IL-12的含量;在共孵育3天时,收集DC激活的淋巴细胞进行T亚群、T辅助细胞亚群的检测。同时,以单纯ConA和IL-2刺激而来的淋巴细胞为对照。结果未活化淋巴细胞培养上清液和经DC活化的淋巴细胞培养上清液中IL-12水平分别为32.5±26.5pg/ml和66.9±41.2pg/ml,经DC活化的淋巴细胞培养上清液中IL-12水平远高于仅用IL-2、ConA刺激的淋巴细胞培养上清。 <WP=7>将DC与自体淋巴细胞共同培养后, CD3+/CD4+T和CD3+/CD8+T细胞比例增加,Th1(CD4+/Cy IFNγ+)/Th2(CD4+/CyIL-4+)比例增加,CD8+ / CD4+T、 Th1/Th2比例分别由诱导前的0.8、1增加为3.6、9.6。DC激活的杀伤细胞对自体白血病细胞的杀伤活性的检测采用MTT法测定杀伤活性。将冻存的自体CML细胞复苏后在干细胞培养液中培养24小时,用淋巴细胞分离液去除死细胞,调整细胞浓度为2×105/ml,做靶细胞用。K562、HL60为对照。收集共孵育3天的CML-DC刺激的淋巴细胞为效应细胞,按效应细胞:靶细胞(效靶比)1:1,10:1,20:1的比例加入96孔圆底培养板中培养6小时,用MTT法检测杀伤效率。以单纯ConA和IL-2刺激而来的淋巴细胞和新分离的淋巴细胞为对照。随着效应细胞/靶细胞比例的提高,效应细胞对靶细胞的杀伤效率提高。当效靶比为20:1时,CML-DC/AL组对自体白血病细胞的杀伤作用[(80.67±6.43)%]明显强于仅用IL-2与ConA刺激的淋巴细胞[(25.33±5.69)%], ( p<0.05)。我们的研究结果显示,CML细胞可以被诱导为DC。用白血病来源的DC刺激自体T细胞能使T细胞抗自身白血病的活性明显增强。此外,DC与T细胞共孵育后,可以分泌大量IL-12,主导了TH1型的细胞免疫应答,利于肿瘤病灶的清除。现在已成功地在体外用细胞因子组合诱导出了形态及功能均
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