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第一部分MIRI小鼠心脏和引流淋巴结Tregs细胞数目变化目的:结扎小鼠冠状动脉左前降支(LAD),建立MIRI模型,观察心脏组织和心脏引流淋巴结中调节性T细胞(Tregs细胞)数目的变化规律。方法:建立小鼠心肌缺血再灌注(MIRI)模型,分为四组:(1)假手术d7组:只穿针,不结扎,第7日麻醉取心脏和引流淋巴结;(2)MIRI d3组:缺血30分钟,再灌注后3日麻醉取心脏和引流淋巴结;(3)MIRI d7组:缺血30分钟,再灌注后7日麻醉取心脏和引流淋巴结;(4)MIRI d14组:缺血30分钟,再灌注后14日麻醉取心脏和引流淋巴结。应用流式细胞术(FCS)检测引流淋巴结中CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs占CD4细胞比例和数目,应用免疫组化染色检测心肌缺血区Foxp3~+细胞数目。结果:在不同时间点,较之假手术组,MIRI组心脏引流淋巴结中CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞占CD4~+细胞比例显著增加,其中以MIRI d7组最高(MIRI 3天12.24%,7天20.85%,14天13.50%;假手术7天9.30%)。类似的,MIRI组心脏中Foxp3~+调节性T细胞数目显著增多,其中以MIRI d7组最高(MIRI 3天12.80个/mm~2,7天23.80个/mm2,14天8.40%;假手术7天2.20%)。结论:心肌缺血再灌注能够活化心脏组织和引流淋巴结中Tregs。第二部分IL-2C能够减轻MIRI目的:通过建立小鼠MIRI模型,探讨IL-2C干预对MIRI损伤、炎症、心肌细胞凋亡的影响。方法:建立小鼠MIRI模型,为研究术前IL-2C处理对MIRI的作用,将C57BL/6小鼠分为以下三组:(1)假手术组,按照MIRI模型方法,只穿线不结扎;(2)PBS组,MIRI术前连续3天给予PBS,阻断左前降支缺血30mins;(3)IL-2C组,MIRI术前3天连续给予IL-2C(IL-2:IL-2C按1mg:5mg比例混合,在37.0℃温水孵育30分钟),阻断左前降支缺血30mins。为研究术后IL-2C处理对MIRI的影响,拟将C57BL/6分为以下两组:(1)PBS组,MIRI术后连续3天给予PBS,阻断左前降支缺血30mins;(2)IL-2C after组,MIRI术后3天给予IL-2C(IL-2:IL-2C按1mg:5mg比例混合,在37.0℃温水孵育30分钟),阻断左前降支缺血30mins。以上各组,在不同的再灌注时间点检测心梗面积,心功能,Tregs细胞数目,心肌凋亡,淋巴细胞增殖反应,炎症性细胞和细胞因子表达。结果:首先,我们发现连续3天IL-2C处理能够显著扩增小鼠脾脏和心脏Tregs。紧其次,我们发现IL-2C治疗能够减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤,表现为,与对照组相比,IL-2C治疗可减少心梗面积、提升心脏功能、降低心肌损伤标志物。进一步的机制研究显示,较之对照组,IL-2C治疗能够抑制心肌细胞凋亡,伴随有心脏中性粒细胞、巨噬细胞浸润以及心肌纤维化减轻,而血管增生、心脏细胞增殖显著增加,同时伴随有脾脏淋巴细胞增殖减弱,Th1细胞、Th17细胞数目减少,然而NKT细胞和DC成熟度无明显变化。RT-PCR显示:IL-2C治疗组中,心肌组织中TNF-α、IFN-g、IL-12和IL-17A的m RNA水平较对照组显著下降,而TGF-b1、IL-10、IL-13、Arginase 1和CD206的m RNA水平则显著上调。最后,我们发现:MIRI术后给予IL-2C治疗,心肌梗死面积和心脏功能较对照组无明显改变。尽管如此,术后给予IL-2C仍可减轻MIRI心肌炎症因子表达和心肌纤维化程度。结论:IL-2C能扩增Tregs,抑制MIRI时心肌细胞凋亡、炎症反应、心肌纤维化,从而减轻MIRI。而术后给予IL-2C能减轻炎症反应,心肌纤维化,但对MIRI后心肌梗死面积和心功能无作用。第三部分Tregs细胞在IL-2C介导保护MIRI中的作用目的:通过建立小鼠MIRI模型,探讨去除Tregs和阻断TGF-b1或IL-10对IL-2C保护MIRI的影响。方法:建立小鼠MIRI模型,为研究Tregs在IL-2C保护MIRI中的作用,将C57BL/6小鼠分为以下两组组:(1)IL-2C组,MIRI术前3天给予IL-2C,术前1天给予0.3mg同型对照抗体,阻断左前降支缺血30mins;(2)IL-2C/PC61组,MIRI术前3天给予IL-2C,术前1天给予0.3mg anti-CD25抗体(PC61),阻断左前降支缺血30mins。为研究TGF-b1和IL-10在IL-2C保护MIRI中的作用,拟将C57BL/6分为以下三组:(1)IL-2C组,MIRI术前3天给予IL-2C,术前1天给予150mg同型对照抗体,阻断左前降支缺血30mins;(2)IL-2C+anti-TGF-b1组,MIRI术前3天给予IL-2C,术前1天给予150mg anti-TGF-b1抗体,阻断左前降支缺血30mins;(3)IL-2C+anti-IL-10组,MIRI术前3天给予IL-2C,术前1天给予150mg anti-IL-10抗体,阻断左前降支缺血30mins。以上各组,在不同的再灌注时间点检测心梗面积、心功能。结果:研究发现,CD25抗体(PC61)可完全去除小鼠体内Tregs,去除Tregs可显著增加MIRI心肌梗死面积,加剧心功能恶化。然而,单纯中和TGF-?1或IL-10都不增加MIRI心肌梗死面积。结论:阻断Tregs可完全抑制IL-2C保护MIRI的作用,然而,抑制TGF-?1或IL-10无法阻断IL-2C对MIRI的保护作用。