妊娠母猪早期胚胎丢失率高达40%,与目前的集约化养殖模式及妊娠定位栏的使用而限制母猪运动有密切关系。然而制动应激如何诱发早期胚胎丢失的机制尚不完全清楚。本实验室前期研究发现交感神经参与妊娠小鼠胚胎着床的调节。因此,本研究以交感肾上腺系统为切入点,探讨制动应激影响胚胎着床的作用机制。选用8周龄雌性CD1小鼠,妊娠E1(Embryonic day1)时,分为对照组和制动应激组,应激妊娠小鼠从E1升始经历连续制动应激直至E7(4h/d),并分别在E3、E5和E7取妊娠母鼠血浆、子宫组织等进行检查。主要研究结果如下：1、制动应激对孕鼠胚胎着床数目和性器官指数的影响E1母鼠经历每天4h,连续3d、5d和7d制动应激之后,与同一妊娠日龄对照组相比,血浆中应激激素--皮质酮和去甲肾上腺素含量均分别增加了69.00%-88.27%(P=0.000～0.0]9)和11.03%-39.49%(P=0.002～0.049),血糖水平提高7.93%-26.97%(P=0.000～0.032),证实制动应激妊娠小鼠模型被复制成功。并且制动应激诱导孕鼠的胚胎着床位点分别降低了]5.29%(E5,P=0.346)和26.07%(E7,P=0.003),以及性器官(子宫和卵巢)指数分别降低了16.15%(E5,P=0.004)和19.97%(E7,P=0.019)。2、制动应激对孕鼠子宫局部着床平台重建的影响子宫内膜发育可以作为评价子宫内膜容受性的指标之一。与相应妊娠日龄对照组相比,制动应激诱导E3-E7孕鼠子宫内膜面积比例降低了8.94%-18.80%(P=0.000-0.021),诱导E3和E5子宫腺面积比例降低了30.63%(P=0.000)和44.52%(P=0.000),诱导作为调节子宫内膜重建及血管发育的MMP-9蛋白的表达降低24.67%-63.45%(E3-E7,P=0.000～0.028)、血管内皮生长因子VEGF阳性细胞的平均光密度(MOD)降低14.55%-45.87%(E3-E7,P=0.000～0.018)和CD34阳性细胞的MOD在E5和E7分别降低37.16%(P=0.003)和70.54%(P=0.000)。利用PCNA和TUNEL方法分别检测子宫内膜细胞的增殖与凋亡状态。制动应激诱导E3-E7孕鼠子宫组织的MODPCNA/MODTUNEL比值降低了32.37%-39.75%(P=0.002-0.011),而反映细胞凋亡的Caspase-3蛋白增加了30.10%-44.69%(P=0.001-0.019)。这说明制动应激主要通过促进子宫内膜细胞的凋亡,抑制子宫内膜及血管的发育,降低子宫内膜容受性,使胚胎着床位点减少。3、制动应激对孕鼠子宫局部免疫应答调节的影响制动应激诱导E3-E7孕鼠子宫内膜uNK细胞密度下降22.14%-47.90%(P=0.000),而子宫肌层肥大细胞(MC)密度增加55.65%-76.91%(P=0.000～0.002)；T淋巴细胞的增殖活性降低5.61%-7.30%(P=0.002～0.022)；E5和E7孕鼠子宫B淋巴细胞增殖活性分别降低17.58%(E5,P=0.002)和8.28%(E7,P=0.017)；E3-E7孕鼠子宫CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值降低26.16%-28.91％(P=0.001-0.027),IL-/IL-4比值降低7.91%-16.21%(P=0.000)。这些结果表明,制动应激扰乱子宫局部免疫微环境,主要表现为降低保护性免疫细胞uNK密度,增加炎性细胞MC密度；降低子宫T和B淋巴细胞增殖活性及CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞比例,从而扰乱Th1/Th2的平衡向Thl炎性状态发展,不利于胚胎的着床和发育。4、制动应激对孕鼠子宫局部抗氧化能力的影响制动应激诱导E5和E7孕鼠子宫组织中GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)含量分别降低32.16%(P=0.011)和45.71％(P=0.000),T-SOD(超氧化物歧化酶)含量分别降低15.52%(P=0.045)和26.13%(P=0.014),T-AOC(总抗氧化能力)分别降低18.45%(P=0.000)和18.19%(P=0.001),而脂质过氧化产物MDA(丙二醛)含量增加34.37%(P=0.042)和42.96%(P=0.019)。并且外源性100、200、400、800、1000μM H2O2作用于体外培养的孕鼠子宫内膜基质细胞(ESCs),MTT检测发现,细胞增殖活性降低22.74%-61.01%(P=0.000),呈剂量依赖性。说明制动应激诱导子宫局部氧化应激,从而抑制子宫内膜细胞的增殖。5、制动应激影响孕鼠子宫发育的胞内信号途径研究表明,ERK和NF-κB参与氧化应激诱导的细胞凋亡。在本研究中,Western Blot (WB)检测发现制动应激组E3-E7孕鼠子宫组织中pERK1/2蛋白表达增加38.85%-52.30%(P=0.025～0.049), pNF-KBp65蛋白表达增加54.38%-74.47%(P=0.001-0.019)。制动应激诱导的去甲肾上腺素的释放,只有通过与其β-AR结合才能发挥生物学信号。在本研究中,采用RT-PCR方法检测到E3-E7孕鼠子宫组织中存在3种β-AR mRNA的表达,较β1-AR和β3-AR mRNA相比,制动应激能显著激活β2-AR mRNA的表达。WB检测发现制动应激诱导E5和E7子宫组织中β2-AR蛋白表达增加52.30%(P=0.003)和28.77%(P=0.042)。免疫组化染色显示β2-AR阳性细胞分布于子宫肌层、腺上皮细胞、腔上皮细胞和蜕膜细胞中,以及体外分离的子宫内膜基质细胞中。这表明β2-AR在制动应激孕鼠模型中发挥主要作用。体外分离E5孕鼠子宫内膜基质细胞,添加外源性β-AR激动剂异丙肾上腺素(ISO)使细胞增殖活性降低了38.60%(P=0.000),同时Caspase-3的含量增加了98.98%(P=0.026)；添加腺苷环化酶激动剂--毛喉素(FSK)对ISO的刺激产生协同作用,说明β-AR通过激活胞内cAMP,显著抑制细胞增殖活性,促进基质细胞的凋亡。而添加外源性β2-AR阻断剂(Butoxamine)和PKA抑制剂H-89,能显著逆转ISO对细胞的抑增殖与促凋亡作用。添加外源性MEK抑制剂PD98059和NF-κB抑制剂PDTC使细胞增殖活性分别增加了36.31%(P=0.001)和40.80%(P=0.000),而Caspase-3的含量显著降低了52.15%(P=0.017)和74.79%(P=0.002)。同时在不同药物添加组中pERK1/2表达的变化趋势与Caspase-3表达趋势一致,这说明ERK1/2的活化涉及细胞的凋亡。因此,这些结果说明,制动应激激活β2-AR,通过经典cAMP-PKA途径,诱导ERKI/2磷酸化,激活NF-κB进入细胞核,诱导Caspase-3含量增加,抑制内膜细胞增殖并促进细胞凋亡。综上,制动应激激活孕鼠SAS,刺激皮质酮和去甲肾上腺素等应激激素分泌,经p2-AR介导,激活胞内cAMP以及下游PKA信号,直接激活或者间接通过诱导子宫局部的氧化应激产生ROS激活ERK1/2磷酸化,一方面直接激活NF-κB进入细胞核,与靶基因结合,产生炎性细胞因子IL-2,使子宫局部Th1/Th2平衡偏向于Th1炎性状态,诱导着床期子宫的局部免疫平衡紊乱；另一方面增加子宫组织Caspase-3的蛋白表达,诱导子宫内膜细胞凋亡,阻滞子宫内膜的妊娠适应性重建,导致子宫内膜容受性的降低,从而不利于胚胎的着床和发育。