研究背景及目的:器官移植已成为治疗终末期器官衰竭的唯一有效手段,挽救了众多患者的生命。在器官移植中,供体器官的保存有着举足轻重的地位;供体器官保存不当或器官保存时间过长,会导致移植后移植物功能恢复延迟,严重者可直接导致移植物失功。因此,如何进一步改善供体的冷保存方法,将有助于提高器官保存的效果和延长保存时间,避免或减轻用于运输时间过长等原因导致的移植失败。同时已有研究表明器官冷保存与移植后再灌注损伤的发生密切相关,缺血再灌注诱发的天然免疫反应也直接影响同种抗原介导的排斥反应产生的强度,越来越受到科学家的重视。因此,研究器官的冷缺血保存方法,防治器官移植后再灌注诱发的天然免疫,将有助于更有效控制排斥反应,受到移植学界的重视。自上世纪30年代就有科学家提出体外保存器官的想法,但限于材料学与生理的认知不足一直未取得突破性进展。随着对胶体渗透压重要性的逐步认知,1988年UW液(University of Wisconsin solution)研制成功并应用于临床。虽然UW液可有效保存多种器官,成为了器官保存液的“金标准",但仍然存在某些不足。后续还研制出了HTK、Celsior、Polysol、SCOT以及CZ-1等保存液,这些保存液都以各自的方式解决器官保存中的缺血再灌注损伤问题。目前,低温保存仍在器官保存中占统治地位,而器官保存液是低温保存技术的核心。器官移植领域的发展目前受到供体短缺的制约,为了解决这一问题,大量边缘供体应用于临床,进而对于器官保存液的要求也越来越高。二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)是一种常温无色无臭含硫有机化合物,有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、可与任意比例水混溶的特性。在早期临床应用中即被用作羟自由基清除剂和冷冻保护剂。近年来DMSO还被证实可用于治疗多种固有免疫引起的炎症性疾病,如:前列腺炎、克罗恩病与肾小球肾炎等。此外,2010年Kloverpris等报道了长时间暴露于DMSO可导致T细胞免疫功能缺失,2015年Gu-Jiun Lin等报道DMSO可以促进regulatory T cells(T-reg细胞)的增殖。因此,在探索如何进一步改进器官保存液的过程中,我们将研究重点放在了小分子化合物二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)上。鉴于上述DMSO的抗炎以及抗氧化的作用,我们用小鼠颈部异位心脏移植模型对DMSO是否可以用于延长移植供体保存时间进行了研究。我们的结果表明DMSO可以显著延长C57BL/6小鼠心脏的冷保存时间。为阐明这种保护作用,我们对DMSO对于心脏冷保存期间心肌变化及移植再灌注损伤的作用进行了研究,为阐述DMSO在器官冷保存及移植再灌注反应中的作用和机制提供实验数据。第一部分:DMSO延长小鼠心脏冷保存时间的体内效果研究目的:建立小鼠颈部心脏同系异体移植模型,体内研究DMSO延长小鼠心脏冷保存时间的效果。方法:1)、选取6周龄的体重、性别相匹配的C57BL/6小鼠作为供体,8周龄的体重、性别相匹配的C57BL/6小鼠作为受体,行颈部异位心脏移植术。心脏保存于不同DMSO浓度的生理盐水中,研究小鼠心脏冷缺血保存极限时间(对照组用生理盐水)。移植物存活为判断标准。2)研究最适DMSO浓度下小鼠心脏冷缺血保存时间心肌损伤效果并进行组织学检测。结果:经过DMSO处理的供体心脏与盐水保存的对照组相比,冷保存时间有不同程度的增加;其中0.5%DMSO为最适保存浓度,可在安全条件下最显著延长保存时间。HE染色显示再灌注后实验组小鼠心肌细胞水肿、坏死等较对照组明显减轻;免疫组化显示实验组与对照组心肌凋亡状况在再灌注之前无显著差异,再灌注后随DMSO浓度升高开始出现差异。结论:DMSO可以延长移植物冷保存时间,减轻移植再灌注损伤。第二部分:DMSO对同系心脏移植后再灌注损伤的作用及机制目的:研究DMSO对器官移植后再灌注损伤的作用及机制。方法:1)选择最佳DMSO浓度保存心脏6小时(对照组用生理盐水),进行同系移植后:移植4小时、12小时后ELISA法检测血清心肌酶谱、心肌损伤标志物、MDA、炎症因子;2)RT-PCR检测移植物中细胞因子表达情况;3)Western-blot检测再灌注后NF-κB、JNK-1、ERK1/2、p38MAPK、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9的表达情况;4)体外培养C57BL/6小鼠原代心肌细胞,实验组应用最适浓度DMSO后行体外模拟冷缺血再灌注实验,Western-blot检测心肌细胞NF-κB、JNK-1、ERK1/2、p38MAPK、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9的表达情况。结果:经过DMSO处理的小鼠心脏再灌注后,TNF-α和IL-1β显著低于对照组,IL-6与对照组无显著差异。在相同再灌注时间下TNF-α、IL-1β和IL-6水平随保存时间的延长而升高。受体小鼠心肌损伤标志物、心肌酶谱、MDA各项指标与对照组相比均有不同程度降低;RT-PCR的结果与ELISA结果相同;DMSO处理的心肌细胞缺氧复氧后活力明显高于对照组。实验组磷酸化Bcl-2表达高于对照组,p-p65、p-JNK-1、Bax、cleaved caspases-3、cleaved caspases-9表达低于对照组,p-ERK1/2、p-p38无显著差异;体外实验结果与体内实验结果相同。结论:DMSO可通过NF-κB通路减轻移植物冷保存后移植再灌注介导的固有免疫损伤,并减轻线粒体途径介导的心肌细胞凋亡。