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目的：
帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是继阿尔茨海默病之后第二常见的神经退行性疾病。这是一种慢性疾病，其原因是中脑黑质中多巴胺能神经元的选择性变性坏死。多项研究已表明PD的发病及其进程是由多种分子机制参与的，其发病机制涉及许多因素和途径，包括氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎症和凋亡等。目前PD治疗旨在缓解疾病的症状，减少功能残疾，以及预防长期并发症。帕金森病治疗中，阻止疾病进展的治疗仍然是目前治疗的困境。疾病修饰治疗是目前研究的热点，疾病修饰治疗是为减缓临床进展到晚期疾病里程碑的干预措施。治疗可以通过抑制原发性神经退行性过程(“神经保护”)或促进大脑中的代偿和再生机制(“神经修复”)来实现这一结果。帕金森病的发病机制是多因素的，要找到一颗“灵丹妙药”来阻止PD的神经变性是具有挑战性的。PD目前的治疗仍不能满足临床治疗需求,尚无针对延缓神经变性过程的有效药物，阻止疾病进展的治疗仍然是目前治疗的困境。
近几年来，药物化学家越来越关注海洋来源的各种生物碱，主要是因其化学结构的新颖和生物活性的独特。其中的吡咯类海洋生物碱成为关注的焦点，是近几年来研究的热点，不断涌现出与其相关联的药物合成和结构改造，以及药理活性的研究等文献报道。吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物经前期实验初步证实此类化合物对损伤的神经元细胞有一定的保护作用。本实验主要是探讨吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用及保护机制。方法：
第一部分:吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用
1.利用CCK8比色法检测细胞生存率，分析不同浓度的MPP+以及NeolamellarinA类似物分别对PC12细胞活力的影响。建立MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤模型，以及分析不同浓度的NeolamellarinA类似物对PC12细胞活力的影响。
2.实验分组为对照组、MPP+处理组和不同浓度的NeolamellarinA类似物预处理后再加入MPP+处理组，利用CCK8比色法检测细胞生存率，分析不同浓度的吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的PC12细胞损伤的影响，选取最佳浓度区间的NeolamellarinA类似物作为后续实验用药浓度。
3.应用蛋白印迹法(Western blot)检测对照组、MPP+处理组和NeolamellarinA类似物预处理后再加入MPP+处理组的氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、α-synuclein的表达。
第二部分:吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制
1.实验分组为对照组、MPP+处理组和NeolamellarinA类似物预处理后再加入MPP+处理组，运用双氯荧光黄乙酸乙酯(DCF-DA)染色检测各组细胞内活性氧(ROS)的生成量，应用比色法检测各组细胞总谷胱甘肽(GSH)含量，应用JC1染色检测各组细胞线粒体膜电位(ΔΨM)。
2.应用蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白(Cyt-C、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白)的表达。
结果：
第一部分:吡吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用
1、MPP+对PC12细胞增殖具有明显的抑制作用。与对照组相比，同一浓度MPP+组，随着时间延长，细胞生存率逐渐下降。同一时间点，随着MPP+组浓度逐渐增高，细胞生存率逐渐下降(P<0.05)。
2、设置不同的浓度梯度，发现浓度为10-7~10-11mol/L的NeolamellarinA类似物作用于PC12细胞24小时后，不影响PC12细胞的活力。而用浓度为10-6mol/L及10-5mol/L的吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物分别处理细胞24小时后，PC细胞的细胞活力仅为对照组的78.90%和62.21%，影响PC12细胞活力，(P<0.05，差别有统计学意义)。
3、0.5mmol/LMPP+孵育PC12细胞24小时后，细胞存活率降低至对照组的77.36％，与对照组相比，差别有高度统计学意义(P<0.05)。不同浓度NeolamellarinA类似物(10-7-10-11 mol／L)预孵育2h后再加入MPP+，可见细胞存活率增高(与模型组比，P<0.05,差别有统计学意义)，其中浓度为10-9mol/L的作用较其他组明显。
4、吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元中TH蛋白、α-synuclein表达的影响：应用MPP+(0.5mmol/L)孵育PC12细胞24h后，与对照组相比，TH蛋白表达减弱，α-synuclein蛋白水平增加(P<0.05)；吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物预干预后，TH蛋白表达增强，α-synuclein蛋白水平下降，(与模型组相比，P<0.05)。
第二部分:吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制
一、吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元氧化应激的影响
1．MPP+对PC12细胞的氧化应激具有明显的影响作用，可致PC12细胞ROS生成增多、总谷胱甘肽(GSH)含量降低(与对照组相比，P<0.05)。
2、经吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物预处理后，可减少ROS生成，总谷胱甘肽(GSH)含量增加(与模型组比较，P<0.05)。
3.MPP+损伤的PC12细胞中线粒体膜电位ΔΨM降低(与对照组相比P<0.05)，NeolamellarinA类似物预处理后能稳定线粒体膜电位，ΔΨM升高(与模型组相比，P<0.05)。
二、吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元细胞凋亡的影响
1.MPP+处理PC12细胞后，胞浆中CytC含量升高(与对照组相比P<0.05)。10-9mol/L浓度的NeolamellarinA类似物预处理后，可拮抗MPP+损伤引起的CytC从线粒体至细胞浆的释放(与模型组相比，P<0.05)。
2.MPP+处理PC12细胞后，能够导致凋亡蛋白Caspase-3的激活，降低Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白的表达(与对照组相比，P<0.05),NeolamellarinA类似物预干预后，可以拮抗MPP+导致的PC12细胞凋亡，降低Caspase-3、Bax蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比率(与模型组相比，P<0.05)。
结论：
吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤有保护作用，它能抑制MPP+引起的PC12细胞内α-synuclein蛋白过表达，增强TH蛋白的表达，从而减少α-synuclein对细胞的损伤，从而对PC12细胞有保护作用。吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物可以通过减少ROS生成，总谷胱甘肽(GSH)含量增加、稳定线粒体膜电位的作用机制来拮抗MPP+诱导的PC12细胞的氧化应激损伤。同时能够减少CytC从线粒体释放至细胞质，拮抗MPP+诱导的PC12细胞凋亡关键分子Caspase-3的活化，上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白的表达，从而通过抑制细胞凋亡的作用机制来保护MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤。吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤有保护作用，是通过拮抗氧化应激、减少细胞凋亡的机制起到保护作用，为海洋药物的新用途和进一步开发为可用于临床防治的新药提供实验依据。
帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是继阿尔茨海默病之后第二常见的神经退行性疾病。这是一种慢性疾病，其原因是中脑黑质中多巴胺能神经元的选择性变性坏死。多项研究已表明PD的发病及其进程是由多种分子机制参与的，其发病机制涉及许多因素和途径，包括氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎症和凋亡等。目前PD治疗旨在缓解疾病的症状，减少功能残疾，以及预防长期并发症。帕金森病治疗中，阻止疾病进展的治疗仍然是目前治疗的困境。疾病修饰治疗是目前研究的热点，疾病修饰治疗是为减缓临床进展到晚期疾病里程碑的干预措施。治疗可以通过抑制原发性神经退行性过程(“神经保护”)或促进大脑中的代偿和再生机制(“神经修复”)来实现这一结果。帕金森病的发病机制是多因素的，要找到一颗“灵丹妙药”来阻止PD的神经变性是具有挑战性的。PD目前的治疗仍不能满足临床治疗需求,尚无针对延缓神经变性过程的有效药物，阻止疾病进展的治疗仍然是目前治疗的困境。
近几年来，药物化学家越来越关注海洋来源的各种生物碱，主要是因其化学结构的新颖和生物活性的独特。其中的吡咯类海洋生物碱成为关注的焦点，是近几年来研究的热点，不断涌现出与其相关联的药物合成和结构改造，以及药理活性的研究等文献报道。吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物经前期实验初步证实此类化合物对损伤的神经元细胞有一定的保护作用。本实验主要是探讨吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用及保护机制。方法：
第一部分:吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用
1.利用CCK8比色法检测细胞生存率，分析不同浓度的MPP+以及NeolamellarinA类似物分别对PC12细胞活力的影响。建立MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤模型，以及分析不同浓度的NeolamellarinA类似物对PC12细胞活力的影响。
2.实验分组为对照组、MPP+处理组和不同浓度的NeolamellarinA类似物预处理后再加入MPP+处理组，利用CCK8比色法检测细胞生存率，分析不同浓度的吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的PC12细胞损伤的影响，选取最佳浓度区间的NeolamellarinA类似物作为后续实验用药浓度。
3.应用蛋白印迹法(Western blot)检测对照组、MPP+处理组和NeolamellarinA类似物预处理后再加入MPP+处理组的氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、α-synuclein的表达。
第二部分:吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制
1.实验分组为对照组、MPP+处理组和NeolamellarinA类似物预处理后再加入MPP+处理组，运用双氯荧光黄乙酸乙酯(DCF-DA)染色检测各组细胞内活性氧(ROS)的生成量，应用比色法检测各组细胞总谷胱甘肽(GSH)含量，应用JC1染色检测各组细胞线粒体膜电位(ΔΨM)。
2.应用蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白(Cyt-C、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白)的表达。
结果：
第一部分:吡吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用
1、MPP+对PC12细胞增殖具有明显的抑制作用。与对照组相比，同一浓度MPP+组，随着时间延长，细胞生存率逐渐下降。同一时间点，随着MPP+组浓度逐渐增高，细胞生存率逐渐下降(P<0.05)。
2、设置不同的浓度梯度，发现浓度为10-7~10-11mol/L的NeolamellarinA类似物作用于PC12细胞24小时后，不影响PC12细胞的活力。而用浓度为10-6mol/L及10-5mol/L的吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物分别处理细胞24小时后，PC细胞的细胞活力仅为对照组的78.90%和62.21%，影响PC12细胞活力，(P<0.05，差别有统计学意义)。
3、0.5mmol/LMPP+孵育PC12细胞24小时后，细胞存活率降低至对照组的77.36％，与对照组相比，差别有高度统计学意义(P<0.05)。不同浓度NeolamellarinA类似物(10-7-10-11 mol／L)预孵育2h后再加入MPP+，可见细胞存活率增高(与模型组比，P<0.05,差别有统计学意义)，其中浓度为10-9mol/L的作用较其他组明显。
4、吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元中TH蛋白、α-synuclein表达的影响：应用MPP+(0.5mmol/L)孵育PC12细胞24h后，与对照组相比，TH蛋白表达减弱，α-synuclein蛋白水平增加(P<0.05)；吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物预干预后，TH蛋白表达增强，α-synuclein蛋白水平下降，(与模型组相比，P<0.05)。
第二部分:吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制
一、吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元氧化应激的影响
1．MPP+对PC12细胞的氧化应激具有明显的影响作用，可致PC12细胞ROS生成增多、总谷胱甘肽(GSH)含量降低(与对照组相比，P<0.05)。
2、经吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物预处理后，可减少ROS生成，总谷胱甘肽(GSH)含量增加(与模型组比较，P<0.05)。
3.MPP+损伤的PC12细胞中线粒体膜电位ΔΨM降低(与对照组相比P<0.05)，NeolamellarinA类似物预处理后能稳定线粒体膜电位，ΔΨM升高(与模型组相比，P<0.05)。
二、吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元细胞凋亡的影响
1.MPP+处理PC12细胞后，胞浆中CytC含量升高(与对照组相比P<0.05)。10-9mol/L浓度的NeolamellarinA类似物预处理后，可拮抗MPP+损伤引起的CytC从线粒体至细胞浆的释放(与模型组相比，P<0.05)。
2.MPP+处理PC12细胞后，能够导致凋亡蛋白Caspase-3的激活，降低Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白的表达(与对照组相比，P<0.05),NeolamellarinA类似物预干预后，可以拮抗MPP+导致的PC12细胞凋亡，降低Caspase-3、Bax蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比率(与模型组相比，P<0.05)。
结论：
吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤有保护作用，它能抑制MPP+引起的PC12细胞内α-synuclein蛋白过表达，增强TH蛋白的表达，从而减少α-synuclein对细胞的损伤，从而对PC12细胞有保护作用。吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物可以通过减少ROS生成，总谷胱甘肽(GSH)含量增加、稳定线粒体膜电位的作用机制来拮抗MPP+诱导的PC12细胞的氧化应激损伤。同时能够减少CytC从线粒体释放至细胞质，拮抗MPP+诱导的PC12细胞凋亡关键分子Caspase-3的活化，上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白的表达，从而通过抑制细胞凋亡的作用机制来保护MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤。吡咯类海洋生物碱NeolamellarinA类似物对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤有保护作用，是通过拮抗氧化应激、减少细胞凋亡的机制起到保护作用，为海洋药物的新用途和进一步开发为可用于临床防治的新药提供实验依据。