研究背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染呈世界性流行,我国属HBV感染的地方性高流行区。与欧美国家不同的是,我国的大多数慢性乙型肝炎患者是在围产期或婴幼儿期感染,因感染时免疫系统发育尚不完善,分别有90%和25%发展成慢性感染,其HBV感染的自然史一般可分为三个期：免疫耐受期、免疫清除期和低复制期,部分专家将在低复制期发生的肝炎再活动定义为第四期,即再活动期。在免疫清除期,随着血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平的波动,血清HBeAg合成下降,抗-HBe产生增加,此期的炎症活动有可能会导致自发的HBeAg血清学转换(HBeAg消失及抗-HBe出现)。事实上,在HBV慢性感染的过程中,机体产生的抗-HBe抗体可以和HBeAg在很长的一段时间里(数月至数年)以免疫复合物的形式存在。目前,根据HBeAg状态可将慢性乙型肝炎分为两种类型：HBeAg阳性的慢性乙型肝炎和HBeAg阴性的慢性乙型肝炎。HBeAg阳性的慢性乙型肝炎往往伴随着高水平的病毒复制,而HBeAg阴性的慢性乙型肝炎通常表现为进展性的肝损害,血清ALT以及HBV DNA低水平波动。HBV C基因分为前C区和C区,编码的核心蛋白有两种形式：核壳蛋白(HBcAg,为病毒核壳的结构成分)和分泌性的HBeAg。血清HBeAg滴度受很多因素影响,其中前C/C区变异为其中的一个重要因素。前C/C区变异在转录水平和翻译水平双重层面上影响HBeAg的分泌。在转录水平,基本核心启动子区(basic core promoter, BCP) T1762/A1764变异可使mRNA转录水平下降至野生株的1/5至1/3；在翻译水平,前C区A1896变异使得前C第28位密码子由TGG突变为TAG(终止密码子),导致HBeAg前体翻译提前终止。HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者中T1762/A1764及A1896变异比例较高,而HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清样本中也可发现T1762/A1764及A1896变异,其变异株/野生株比例与血清HBeAg水平相关。慢性HBV感染的血清标志物包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc。五种血清标志物不同的组合模式代表着不同的疾病状态,在慢性乙型肝炎的临床诊断与治疗评价中发挥重要作用。临床中,常见的血清标志物组合模式为HBsAg、HBeAg及抗-HBc同时阳性或者HBsAg、抗-HBe及抗-HBc同时阳性。除此之外,还存在着一些少见模式,如HBsAg与抗-HBs同时阳性、HBeAg及抗-HBe同时阳性等。HBeAg/抗-HBe同时阳性的慢性乙型肝炎在临床免疫清除期患者中经常看到,然而到目前为止,尚无针对此类HBV感染人群的系统性研究。研究目的：本研究目的在于调查HBeAg/抗-HBe双阳性慢性乙型肝炎患者的流行率；分析其人口学、临床指标、病理学、血清学及病毒学特征；并探讨血清HBeAg和抗-HBe同时阳性的可能机制。研究方法：1、收集2002年1月至2009年7月在南方医院感染内科住院的慢性乙型肝炎患者的人口学信息、临床和实验室资料。纳入标准为：1、住院期间诊断为慢性HBV感染,包括慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化代偿期(Child-PughA级)或乙型肝炎肝硬化失代偿期(Child-Pugh B或C级)；2、年龄≥14岁；3、入院前未进行过抗HBV治疗；4、入院前12个月内血清ALT水平间断或持续异常。排除标准为：合并其他病毒感染(如：甲、丙、丁、戊型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒等)；其他原因导致的肝炎(自身免疫性肝病、酒精性肝病、药物性肝损害等)；原发性或继发性肝癌以及由于使用免疫抑制剂或放射治疗等导致的HBV再激活患者。2、根据HBeAg/抗-HBe状态(阴性或阳性)将纳入患者分组,比较各组间人口学、临床指标、病理学、血清学特征。3、根据]HBeAg或抗-HBe检测值(S/CO,雅培i2000或AXSYM)分别将HBeAg单阳性或抗-HBe单阳性慢性乙型肝炎患者各自分为低、中、高滴度三亚组,首先横向比较分析不同HBeAg滴度或抗-HBe滴度单阳性患者亚组间的临床特点。若低、中、高三亚组间临床特点存在差异,则将低滴度单阳性患者与HBeAg/抗-HBe双阳性患者进行纵向比较,分析两组间临床特点的差别。4、对于纳入的HBeAg/抗-HBe双阳性慢性乙型肝炎患者,从本室保存的血清库中查找并调出患者住院时冻存的血清,并通过抽提血清HBV DNA、巢式PCR扩增及直接测序检测HBV的基因型以及基本核心启动子区、前C区和C区变异情况。5、进行HBeAg/抗-HBe双阳性模式的体外模拟实验。第一步,将3对临床血清(HBeAg单阳性血清及抗-HBe单阳性血清各一份为一对)按1：1体积比混合,37℃孵育(以下同)3小时后使用雅培i2000检测HBeAg/抗-HBe。如检测结果为抗-HBe阳性则减少下一次混合时抗-HBe阳性血清所加入的比例,再次混合、孵育、检测,依次循环,直到能够检测到HBeAg及抗-HBe同时阳性。此时加入的HBeAg与抗-HBe单阳性血清的比例,即“合适比例”。根据“合适比例”适当调整多个混合比例,混合后孵育,检测HBeAg及抗-HBe滴度。使混合血清同时具有较高HBeAg及抗-HBe滴度的“合适比例”确定为“最适比例”。第二步,以每对血清的最适比例混合两血清,然后使用小牛血清将混合血清稀释至10～500倍,孵育3小时后进行HBeAg/抗-HBe检测。第三步,以每对血清的最适比例混合两血清,将孵育时间延长至12及24小时,然后进行HBeAg/抗-HBe检测。研究结果：1、纳入的1624例慢性乙型肝炎患者中,169例(10.4%)为HBeAg/抗-HBe双阳性患者,887例(54.6%)为HBeAg单阳性患者,556例(34.2%)为抗-HBe单阳性患者,12例(0.7%)为HBeAg/抗-HBe双阴性患者。因HBeAg/抗-HBe双阴性患者所占比例较小(<1%),未进行进一步分析。2、HBeAg单阳性组(n=887例)、HBeAg/抗-HBe双阳性组(n=169例)及抗-HBe单阳性组(n=556例)三组间的年龄水平及血清HBV DNA水平差异显著(年龄：F=90.180,P<0.001；HBV DNA:F=217.282,P<0.001).HBeAg/抗-HBe双阳性患者的年龄(35.2±11.0岁)及血清HBV DNA水平(5.8±1.5 logcopies/mL)均介于HBeAg单阳性患者(32.0±11.3岁；6.6±1.2 log copies/mL)与抗-HBe单阳性患者(41.0±13.1岁；5.2±1.2 log copies/mL)之间；三组间两两比较,差别均具有统计学意义。三组中双阳性患者的血清ALT水平最高(χ2=12.656,P=0.002),血清总胆红素水平、血清TBIL≥34.2μmol/L的患者比例、肝脏病理炎症分级及纤维化分期均较HBeAg单阳性组高,而与抗-HBe单阳性组相当。3、HBeAg/抗-HBe双阳性组HBeAg滴度显著低于HBeAg单阳性组(Z=-33.934,P<0.001),HBeAg/抗-HBe双阳性组抗-HBe滴度也显著低于抗-HBe单阳性组(Z=-32.039,P<0.001)。双阳性患者的HBeAg滴度及抗-HBe滴度均较低,HBeAg和抗-HBe的中位数(四分位数间距范围)分别为4.2(1.8～9.6)S/CO和0.54(0.27～0.72)S/CO,绝大多数接近于各自的检测临界值。4、根据HBeAg检测值将HBeAg单阳性慢性乙型肝炎患者分为低(1.0<HBeAg≤130.9 S/CO).中(130.9<HBeAg≤293.7 S/CO)、高(HBBeAg>293.7 S/CO)HBeAg滴度三亚组。三亚组间年龄差别显著(F=18.604,P<0.001),以低HBeAg滴度亚组年龄最大(34.8±11.6岁),而高HBeAg滴度亚组年龄最小(29.3±10.1岁)；三亚组间血清HBV DNA水平差别显著(F=64.725,P<0.001),以低HBeAg滴度亚组最低(6.0±1.2 log copies/mL),高HBeAg滴度亚组最高(7.0±1.0 log copies/mL)；三亚组间血清ALT水平差异显著(χ2=9.962,P=0.007),低滴度亚组血清ALT水平在三亚组中最低【中位数(四分位数间距范围),118(47-308)U/L】,中滴度亚组最高【165(75-338)U/L】。另外,低滴度亚组的血清总胆红素水平、肝脏病理炎症分级及纤维化分期在三亚组中最高。5、将低HBeAg滴度亚组与HBeAg/抗-HBe双阳性组比较分析后发现,仅HBeAg/抗-HBe双阳性组血清ALT水平高于低HBeAg滴度组(Z=-2.663,P=0.008),人口学指标及其他临床指标间无差别。6、根据抗-HBe检测值将抗-HBe单阳性乙型肝炎患者分为低(0.105<抗-HBe<1.000 S/CO)、中(0.064<抗-HBe≤0.105 S/CO)、高(抗-HBe≤0.064 S/CO)抗-HBe滴度三亚组后发现,三亚组间血清总胆红素水平有差别(χ2=8.037,P=0.018),以低滴度抗-HBe亚组最高；不同滴度抗-HBe亚组间的平均年龄、血清ALT水平、血清HBV DNA水平及肝脏病理炎症分级及纤维化分期的无差别。7、成功复温的135例HBeAg/抗-HBe双阳性血清中,有134例巢式PCR扩增阳性并成功测序。其中95例(70.9%)为HBV基因B型感染,其余均为HBV基因C型。110例(82.1%)双阳性患者感染了BCP区T1762/A1764和/或前C区A1896终止密码子变异株。8、在HBeAg/抗-HBe同时阳性模式的体外模拟实验中,混合血清37℃孵育3小时后,进行HBeAg及抗-HBe检测(雅培i2000),在三对中均能找到HBeAg及抗-HBe同时阳性的“最适比例”。混合血清经小牛血清稀释至一定比例,HBeAg及抗-HBe仍可同时检测到；如稀释倍数超出一定范围,HBeAg及抗-HBe均检测不到。另外,将孵育时间延长至24小时,HBeAg及抗-HBe仍为同时阳性。与临床双阳性患者血清学特点相似,混合血清HBeAg及抗-HBe滴度也较低,接近于检测的临界值。结论：1、在未行抗病毒治疗的住院慢性乙型肝炎患者中,HBeAg/抗-HBe同时阳性患者并不罕见(占10.4%)。2、HBeAg/抗-HBe双阳性慢性乙型肝炎为慢性HBV感染的自然史中的一个特殊阶段,与更加严重的肝脏疾病相关,此期肝脏病变累积较重。3、机体产生的HBeAg和抗-HBe之间的合适比例为检测出HBeAg和抗-HBe同时阳性的原因之一。4、将HBeAg和抗-HBe同时纳入分类标准可细化分类CHB患者；在HBeAg单阳性患者中,不同HBeAg滴度亚组具有不同的临床特征,HBeAg/抗-HBe双阳性患者与低滴度的HBeAg单阳性患者临床特征相似。