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ErbB受体是酪氨酸激酶受体家族中的一员,与细胞的生长、分化及存活等有关的重要调节因子。根据临床和实验室研究提示,ErbB受体或其配体的表达异常与各种肿瘤的发生有密切相关。Ebpl是一种新发现的ErbB-3胞内结合的碱性蛋白质,它属于增殖相关的PA2G4家族,已证实Ebpl可作为ErbB3信号的下游信号分子,参与肿瘤细胞的生长和增殖,且已证明,HCC的发生和进展过程中需ErbB-2/ErbB-3异二聚体的聚合参与,但是目前为止Ebp1在肝癌中的表达及其在肝癌细胞生长增殖中的作用研究尚未见报道。肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的发生、发展是多因素、多基因参与,且多途径相互作用的过程,故肝癌的分子生物学研究,应从基因水平上进一步探索肝癌的抑癌基因及促癌基因的变化,寻找出在肝癌中明显表达的基因。本次实验中我们首先利用cDNA microarry技术高通量筛选了肝癌组织中差异表达基因,结果发现Ebp1是肝癌中过高表达的基因之一。因此本实验利用Northern bloting技术进一步检测Ebp1基因mRNA在15例癌旁肝组织及肝癌组织中的表达情况,再用Northern bloting技术检测Ebp1基因mRNA在非肿瘤细胞株(HEK293T和Chang liver),乳腺癌细胞株(MCF-10A)及肝癌细胞株(Hep3B、PLC/PRF/5、SK-Hep1、HepG2、Huh7、HLK3、HKK1和SH-J1)中的表达。利用免疫组织化学方法观察肝癌组织芯片中ErbB3蛋白和Ebpl蛋白的差异表达。在此基础上,利用聚合酶连反应技术(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增Ebpl基因,并构建了表达载体pEGFPCl-Ebpl。通过脂质体转染法向HepG2细胞及NIH3T3细胞中转入pEGFPCl-Ebpl基因,利用荧光显微镜,观察绿色荧光蛋白(GFP)在各细胞中的表达。对转染后的HepG2细胞及NIH3T3细胞用G418筛选,并利用免疫荧光染色法,在激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy, LSCM)下观察Ebpl编码蛋白在HepG2细胞及3T3细胞中的定位和表达情况。同时,标记发光良好的单个克隆,并进一步分离及培养细胞,最终建立能够充分表达Ebpl基因的稳定细胞系,我们还利用Western blot方法观测Ebpl蛋白在各种细胞系中的表达。应用细胞计数法检测转染pEGFPC1-Ebpl的HepG2细胞、空载体细胞及阴性对照细胞的生长速度,并检测细胞周期蛋白的表达。本文的主要实验结果如下：1.用cDNA microarray在肝癌组织中筛选了有显著差异表达的基因82个,其中高表达的53个,低表达的29个,这些差异表达基因在肝癌发生发展中的作用研究尚未见报道。2.对15例肝癌组织与癌旁组织进行Northern bloting结果显示, Ebp1mRNA在癌组织中过高表达(overexpression),均有1.7Kb和2.1kb两个片段的表达,其表达量分别是80%和67%。3.与非肿瘤细胞株HEK293T和Chang liver相比,MCF-10A乳腺癌细胞及Hep3B、PLC/PRF/5、SK-Hep1、HepG2、Huh7、HLK3、HKK1和SH-J1等8种肝癌细胞中Ebp1mRNA过高表达,均有1.7Kb和2.1kb两个片段的表达；Ebp1mRNA在HBV相关细胞株(Hep3B, PLC/PRF/5,)和HBV非相关肝癌细胞株(Hep G2,SK-HEP-1和Huh7)之间表达无差异。4.对60个点肝癌组织芯片进行免疫组织化学染色结果,ErbB3和Ebpl蛋白的表达率分别为36.8%和28.3%,ErbB3和Ebpl蛋白的表达与肝癌的病理分级无相关关系。5.重建了Ebpl基因与EGFP基因表达载体pEGFPC1-Ebp1,并可在HepG2肝癌细胞及NIH3T3细胞中均表达。6.转染pEGFPC1-Ebp1的HepG2肝癌细胞及NIH3T3细胞,用G418筛选阳性克隆,可见转染细胞克隆集落明显增多,与pEGFPC,空载体转染细胞相比有显著性差异。7.转染Ebpl基因的细胞形态有明显变化,多数呈不规则伸长,且细胞生长率明显高于空载体对照细胞和阴性对照细胞。8.稳定转染Ebpl的HepG2肝癌细胞克隆集落形成明显多于空载体对照细胞,Ebpl转染细胞生长率明显高于空载体转染细胞。9.将末端标记有GFP的Ebp1瞬间转染到HepG2肝癌细胞及NIH3T3细胞中,并利用鼠抗Ebpl的单克隆抗体,进行免疫细胞化学实验。结果,细胞浆内见大量GFP融合Ebpl蛋白,而在细胞核基本不表达。10.HRG促进稳定转染Ebp1p48的HepG2细胞增殖和迁移,并磷酸化Akt的表达增多。以上结果提示：1.Ebp1在肝癌组织高度表达,是一种新的肝癌相关候选基因。2.本研究构建的Ebp1基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合表达载体pEGFPC1-Ebp1既可作为瞬时表达标记物的定性,又可作为稳定表达的标记物,对Ebp1基因的功能研究具有重要价值。3.Ebp1促进肝癌生长和增殖,并导致Akt的磷酸化,在肝癌发生过程中起促癌作用。