HCC(Hepatocellular Carcinoma,肝细胞肝癌）是全球最常见的癌症类型之一，死亡率排名第二仅次于肺癌，发病率排名第五。近年来在全球尤其是发展中国家的发病率呈现上升趋势。肝癌最常见的病因是HBV和HCV感染，大多数肝癌患者往往在癌症中期或晚期才被诊断，导致难以采用有效的治疗措施，致死率高达95％。但肝癌的病理机制研究远远落后于其他癌症，如乳腺癌和大肠癌等。以往肝癌发病机制相关的研究往往集中于一些关键分子的调控，缺乏对肝癌在疾病发生过程中信号通路的整体综合性分析。虽然基因组及转录组对大规模肝癌临床样本的研究取得了一系列进展，但目前对HBV引发HCC的发病机制仍然不甚清楚。　　蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后的一种重要修饰，在生物体的生命过程中动态的蛋白质磷酸化修饰时刻影响着细胞信号转导、细胞分化和增殖等几乎所有的生命进程。癌症中激酶介导的信号通路异常调控是一个普遍存在的现象，激酶活性的异常增强或失活通过一系列激酶级联放大反应，往往导致下游多个癌症相关信号通路异常激活，或相应的抑癌信号通路失活，与肿瘤的发生、增殖及耐药性等密切相关。借助于快速发展的磷酸化蛋白质组分析策略，已经在肺癌、乳腺癌等研究中，发现了相应的肿瘤标志物，以及采用靶向激酶抑制剂如EGFR抑制剂对肺癌治疗取得了良好疗效，但在肝癌的研究中目前并没有发现类似的靶标分子及特异性激活的信号通路，甚至目前唯一适用于中晚期肝癌治疗的药物索拉非尼（sorafenib)也在大部分病人中无效。因此借助于磷酸化蛋白质组学研究策略，将极大地推动揭示肝癌中蛋白质磷酸化介导的信号通路变化，促进对肝癌发病机制的认识，以及筛选肝癌相关的肿瘤标志物与靶标分子，推动肝癌的防治进程。　　在定量磷酸化蛋白质组学研究中，得益于近些年质谱技术及富集技术的发展，使得对细胞样本、动物模型甚至临床样本进行大规模磷酸化蛋白质组的研究成为可能。但因磷酸化蛋白质组检测过程涉及诸多环节，实验复杂度较高，周期较长，且结合了定量蛋白质组学技术后磷酸化蛋白质组的鉴定及定量面临了更大的挑战，单次实验中难以实现大规模快速及深度磷酸化蛋白质组的定量检测。因此急需在磷酸化蛋白质组富集及定量技术上突破瓶颈，来推动利用磷酸化蛋白质组对癌症的研究。另外磷酸化蛋白质组产出的数据与基因组及蛋白质表达谱数据所不同的是，磷酸化蛋白质组的数据提供了极为丰富的蛋白质磷酸化位点调节信息，但蛋白质在相应位点的磷酸化修饰对其生物学功能的影响，人们仍然知之甚少，因此需要新的分析技术及策略来对磷酸化蛋白质组数据进行解析。　　在对肝癌中的磷酸化网络研究过程中，我们发展出基于非标定量磷酸化蛋白质组检测技术，实现了对微量复杂样本进行高覆盖磷酸化蛋白质组鉴定及定量。利用该技术我们实现了对小鼠肝脏磷酸化蛋白质组的大规模深度检测，共检测到18,789个非冗余磷酸化肽段，两次重复实验中磷酸化位点定量达到相关性（spear- man correlation)为0.88，证明非标定量技术对磷酸化蛋白质组定量的可行性。　　进而，我们利用基于非标定量磷酸化蛋白质组定量检测技术对HCC中的蛋白质磷酸化调控进行了研究。利用HBx转基因小鼠发展成为的HCC模型及其野生对照小鼠，我们获得了目前最大的H C C磷酸化蛋白质组数据，鉴定得到22,568个磷酸化位点，其中1,128个位点在H C C中显著异常表达。对 H C C中磷酸化水平异常调控的蛋白进行通路富集分析后发现涵盖了 HCC中已知的多个信号通路，如 VEGF、FGF信号通路等，表明蛋白质磷酸化在这些通路的异常调控中发挥重要作用。进一步地，我们利用鉴定的异常磷酸化调控位点对可能引起这些变化的激酶进行了预测，得到了多个在H C C中活性异常的激酶家族，如 SFKs，PKCs， MAPKs，揭示了 H C C中存在的以激酶介导的信号通路沉溺(pathway addiction)现象，与癌症的发生发展及癌症的治疗密切相关。随后我们重构出了 HCC中激酶底物调控网络，分析发现涉及从胞膜到胞质，再至核内的多个空间结构中磷酸化的调控，参与了 HCC中细胞粘附、迁移、细胞骨架重塑、转录调控等生物学过程，且 SFKs激酶和PKCs、ROCK2等存在密切相互调节作用，部分激酶参与了 HCC中特定生物学过程调控。同时，代表激酶(PKCs, ROCK2, SRC)的表达在稳转HBx细胞株及临床样本中得到了验证，表明H B x可促进PKCs，ROCK2，SRC等激酶活性。随后利用靶向SRC激酶与PKCs激酶及ROCK2激酶抑制剂，在 HCC细胞模型中发现了显著的抑制协同效应，进一步证明了 HCC中激酶介导的信号通路沉溺现象，同时揭示了选取适当药物联合使用可显著抑制HCC增殖，或可突破癌症药物治疗中抗药性瓶颈，可指导临床用药及实现个体化精准治疗。　　此外，我们分析发现发生在SRCSCT17磷酸化可影响其激酶活性，将构建的稳转 SRCS17a突变株与野生SRC细胞株比较，发现SRC激酶活性在野生细胞株中显著高于突变株，且磷酸化了下游CDK1Tyr15及 ROCK2Tyr256，同时证明ROCK2激酶活性可被S R C直接调控。而细胞迁移实验也证明S R C野生株较SRCs17a突变株有更强的细胞转移能力，提示在H C C中或通过SRC/ROCK2信号通路的磷酸化途径调节HCC的转移侵染能力。即该研究策略不仅能发现癌症中主要活跃激酶家族介导的信号通路沉溺现象，可靶向活跃激酶指导个体化治疗；亦可发现癌症中特异的磷酸化调控机制，为探索癌症发病的可能调节机制提供新的视角，同时该数据也为肝癌研究提供了宝贵资源。　　进一步地，为了适应大规模样本快速检测的需求，我们在已实现的非标定量磷酸化蛋白质组技术基础上，发展出了快速、高通量、深度磷酸化蛋白质组鉴定技术ESPRIT。利用该技术策略，可对微量样本(1-2 m g)实现检测，单次实验可实现8组样本的同时深度磷酸化蛋白组分析，每个样本单次测试可鉴定12,000个磷酸化位点，且两次生物学及技术误差累积后重复实验仍然有非常高的平行性，定量数据相关性（spearman correlation)高达0.85-0.88。该技术可使得单次实验在几小时完成，4h完成质谱检测，不仅在磷酸化组学研究领域其鉴定规模达到了国际先进水平，更在定量水平也达到了极高重现性。利用该技术我们对HepG2及Hep G2.215细胞系进行了深度大规模磷酸化蛋白质组比较分析，共鉴定到21,050个磷酸化位点，其中3,138个磷酸化位点在两个细胞系中显著差异。进一步分析发现在HepG2.2.15细胞相比HepG2细胞，HBV影响了多个激酶介导的信号通路，如酪氨酸激酶相关信号通路及MAPK信号通路，以及两种细胞不同信号通路对磷酸化调节依赖程度不一。该技术应用于微量大规模样本快速磷酸化蛋白质组的研究，支撑了 CNHPP的大规模临床样本的磷酸化蛋白质组数据产出。　　本文的创新点主要有：　　结合非标定量技术与磷酸化肽段富集技术，建立了一套快速、高通量、深度覆盖磷酸化蛋白质组检测技术。　　对 HBx转基因发展为HCC的小鼠模型HCC样本进行了定量磷酸化蛋白质组研究，首次构建了最大的HCC磷酸化蛋白质组数据。　　发现了 HCC中AGC家族PKCs、T K家族SFKs、STE家族MAPKs等激酶异常激活，重构了 H C C中的磷酸化调控网络，并发现了 H C C中PKCs，SFKs， MAPKs等激酶间存在密切相互调节作用。　　靶向SRC，与PKCs或ROCK2激酶抑制剂联合作用，协同抑制HCC细胞增殖的效果，显著好于SRC，PKCs或 ROCK2抑制剂（单独PKCs或 ROCK2抑制剂无显著抑制效果）单个抑制效果，或可指导临床。　　发现SRCSer17磷酸化显著影响其激酶活性，并磷酸化下游ROCK2Tyr256及CDK1Tyr15，SRC/ROCK2途径在HCC细胞转移侵袭能力起重要调控作用。