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乳腺癌是女性发病率较高的常见恶性肿瘤之一,其中三阴性乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的15%-20%,是导致乳腺癌死亡率最高,预后最差的亚型。三阴性乳腺癌是指肿瘤组织免疫组织化学检查结果中雌激素受体（estrogen receptor,ER）,孕激素受体（progestogen receptor,PR）和原癌基因人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）均为阴性的一类特殊表现型。与其他乳腺癌亚型相比,三阴性乳腺癌具有侵袭能力强、进展快、复发率高和远处多发转移的特点。目前,还没有针对三阴性乳腺癌的专门疗法,多采用化疗与手术治疗,治疗效果欠佳。近年研究发现,三阴性乳腺癌具有免疫调节特性,其中的淋巴浸润细胞的数目与良好的临床治疗效果呈正相关。这也提示我们,免疫疗法有潜力成为三阴性乳腺癌的优良疗法。脂肪间充质干细胞是来源于脂肪组织的成体干细胞,具有自我更新和分化潜能,是肿瘤微环境中重要的基质细胞,对免疫系统有调节作用,参与了乳腺癌的发生发展过程。作为细胞间相互作用的一种重要的媒介方式,外泌体是由细胞分泌的具有脂质双分子层的囊泡结构,直径为30-150 nm,表面及内部携带包括核酸和蛋白因子等多种生物活性分子,可在体液中远距离传输并释放携带的功能性分子至受体细胞,进而调节受体细胞的生物学行为。与其母细胞相比,外泌体继承其特性,更易于储存和运输,免疫原性较低。来源于脂肪间充质干细胞的外泌体介导了其母细胞对免疫系统的调节作用,为基于脂肪间充质干细胞的无细胞疗法提供了新的思路。microRNA（miRNA）是一类具有进化保守型单链非编码RNA分子,通过结合3’非翻译区（3’UTR）降低messenger RNA（mRNA）的表达。miRNA长度在18-25 nt,易于装载进入外泌体中,避免被核酸酶降解,并通过外泌体的磷脂双分子层与细胞膜的亲和作用,安全高效地被运输至目标组织和细胞后被释放,从而发挥对靶基因的调节作用。本文围绕外泌体作为miR-424的运输载体通过PD-1/PD-L1信号通路在三阴性乳腺癌治疗研究这一主题,取得如下的研究成果:1、确定了三阴性乳腺癌高表达PD-L1以及PD-L1表达量与临床特征的相关性。我们首先通过下载并分析数据库中的乳腺癌患者的临床数据证实三阴性乳腺癌组织中PDL1表达水平较其他乳腺癌亚型高,在三阴性乳腺癌中,PD-L1的表达水平与患者的年龄和生存状态显著相关,在其他乳腺癌亚型中,PD-L1的表达水平与患者的年龄、癌症级别和生存状态均无相关性。通过生存分析发现,PD-L1表达量与患者的无复发生存期呈正相关。随后,我们比较了不同乳腺癌细胞系中PD-L1的表达水平,发现三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231与HCC9154相比其他乳腺癌细胞系（BT-474,HCC1500,HCC1806）和乳房上皮细胞系MCF-10A,具有更高的PD-L1 mRNA和蛋白表达水平。在乳腺癌细胞系中,miR-424与PD-L1的表达水平呈负相关。三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和HCC9154中miR-424的表达水平降低,PD-L1的表达水平增高。我们随后通过理论预测模型分析miR-424与PD-L1的结合位点,并设计突变位点与相应的引物,通过荧光素酶报告基因检测实验证明miR-424直接结合到PD-L1的3’UTR,从而抑制PD-L1的表达。2、比较将miRNA装载到外泌体中的不同方法并获得可运输miR-424的功能性外泌体。我们首先分析了不同种类间充质干细胞来源的外泌体的miRNA表达图谱,发现来源于脂肪间充质干细胞的外泌体特异性表达的包括miR-424在内的四种miRNA均靶向PDL1。为了提高外泌体中miR-424的含量进而提高miR-424的递送效率,我们比较了三种将miRNA装载进入外泌体的方法的有效性,发现,相比于慢病毒转染和电转染的方法,阳离子脂质体转染可快速有效提高外泌体中miR-424的表达水平,并且对细胞的活力及分泌外泌体的水平影响较小。3、构建体内外模型验证装载miR-424的外泌体（EVs-424）的抗肿瘤功能。我们首先通过共培养三阴性乳腺癌细胞和外周血单核细胞建立体外模型,检测该模型中加入EVs-424后,癌细胞的增殖、凋亡特性,相关细胞分泌因子水平,外周血单核细胞中CD8+T细胞数目的变化,结果显示,EVs-424抑制癌细胞的增殖,促进癌细胞凋亡,刺激促炎性免疫因子IFN-γ和TNF-α的产生,减弱免疫抑制性细胞因子IL-6和IL-10的分泌,并且没有减少CD8+T细胞的数目。之后我们通过向Balb/c小鼠皮下注射乳腺癌细胞和外周血单核细胞构建体内模型,随后进行瘤内注射EVs-424,发现EVs-424减缓了肿瘤的发生发展过程。综上所述,本论文的研究通过三阴性乳腺癌模型中外泌体运输miR-424抑制PD-1/PD-L1信号通路进而发挥抗肿瘤的,丰富了三阴性乳腺癌的免疫治疗方法。