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2 型糖尿病的重要病理生理机制是胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷。目前越来越多的研究表明肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)的激活既可以引起胰岛素抵抗，也可以引起胰岛素分泌缺陷。其中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是该系统的主要效应物质，可引起外周胰岛素靶组织如骨骼肌、脂肪、肝脏的胰岛素抵抗，其作用的主要机制是损害上述组织细胞内的胰岛素信号通路，使胰岛素受体(insulin receptor，InR)／胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)的酪氨酸磷酸化减少，InR／IRS-1的丝氨酸磷酸化增加，进而使葡萄糖转运、糖原合成等能力下降。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介导了Ang Ⅱ对外周胰岛素信号通路的抑制作用。NADPH氧化酶是促进ROS生成的重要酶，其组分包括P47，P67，P22等。Ang Ⅱ显著增加NADPH氧化酶活性和ROS生成；并可减少胰岛素诱导的IRS-1酪氨酸磷酸化、AKT活化和GLUT4向质膜的转位。上述作用可被Ang Ⅱ受体阻断剂losartan或NADPH氧化酶抑制剂apocynin阻断。
近来在多种组织器官中发现具有功能活性的局部RAS系统，其中胰腺也存在局部RAS系统的表达。进一步的研究发现离体胰岛上存在AngⅡ受体，Ang Ⅱ可通过受体直接调节胰岛β细胞功能，增加氧化应激水平，影响胰岛素分泌，胰岛β细胞增殖和凋亡等。
胰岛β细胞同样存在着胰岛素信号通路，包括InR、IRS、P13K(磷脂酰肌醇-3激酶，phosphatidylinositol 3-kinase)等组分。胰岛素可以通过该信号通路调节胰岛细胞存活、胰岛素基因转录／蛋白合成和胰岛素分泌等。如果该通路受损，可导致胰岛β细胞功能异常。那么Ang Ⅱ是否同样影响胰岛β细胞内胰岛素信号通路，从而影响胰岛β细胞功能?本文以胰岛素分泌细胞系NIT-1为模型，观察AngⅡ对胰岛β细胞内胰岛素信号通路的影响并初步探讨其可能机制。
研究目的：
1.观察Ang Ⅱ对胰岛β细胞胰岛素信号通路蛋白磷酸化水平及胰岛素基因转录的影响；
2.探讨Ang Ⅱ影响胰岛β细胞胰岛素信号通路蛋白磷酸化水平及胰岛素基因转录水平的可能机制：氧化应激的作用。
研究方法：
1.细胞培养
DMEM低糖培养基添加10％胎牛血清用于胰岛素分泌细胞株NIT-1培养。待六孔板内细胞长至70-80％时，改为无血清培养液进行处理。
2.实验分组
正常对照组(Ctrl组)；Ang Ⅱ组(A Ⅱ组，Ang Ⅱ 10-6mol／L)；胰岛素组(InS组，INS10-7mol／L)：Ang Ⅱ+胰岛素组(A Ⅱ+Ins组，Ang Ⅱ 10-6mol／L，INS10-7mol／L)；Ang Ⅱ+胰岛素+saralasin组(A Ⅱ+Ins+saralasin组；Ang Ⅱ10-6mol／L，INS 10-7mol／L，saralasin 10-5mol／L)；Ang Ⅱ+胰岛素+DPI组(A Ⅱ+Ins+DPI组，Ang Ⅱ 10-6mol／L，INS10-7mol／L，DPI10-5mol/L)。saralasin为Ang Ⅱ受体拮抗剂，DPI为NADPH氧化酶抑制剂，均在Ang Ⅱ前2小时加入。Ang Ⅱ处理24h后给予胰岛素诱导30min。
3.免疫荧光检测InR-β，IRS-1蛋自在NIT-1细胞上的表达。
4.Western blot检测InR-β酪氨酸磷酸化(InR-β-Tyr)、IRS-1酪氨酸磷酸化(IRS-1-Tyr)、IRS-1丝氨酸磷酸化(IRS-1-Ser)、P47 phox的蛋白表达水平。InR-β-Tyr蛋白表达水平用InR-β-Tyr／InR-β灰度比值表示；IRS-1-Ser蛋白表达水平用IRS-1-Ser／IRS-1灰度比值表示；IRS-1-Tyr蛋白表达水平用IRS-1-Tyr／IRS-1灰度比值表示；P47 phox的蛋白表达水平用P47／beta actin灰度比值表示。利用bandscan 5.0灰度分析软件扫描条带。
5.半定量RT-PCR检测胰岛素基因mRNA的表达情况。insulin mRNA水平用insulin／beta actin灰度比值表示。利用bandscan 5.0灰度分析软件扫描条带。
6.流式细胞仪检测细胞内H2O2水平。
7.统计分析所有实验数据均以SPSS 13.0 for Windows统计软件包进行分析处理。各组均数用-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及两两比较的SNK法，P<0.05视为差异有统计学意义。
结论：
1.小鼠胰岛素分泌细胞株NIT-1细胞存在InR-β蛋白和IRS-1蛋白的表达。
2.AngⅡ增加NIT-1细胞IRS-1-Ser水平，抑制胰岛素刺激的InR-β-Tyr和IRS-1-Tyr水平升高。
3.AngⅡ抑制胰岛素刺激的胰岛素基因转录水平。
4.Ang Ⅱ增加NIT-1细胞的氧化应激水平，并且主要来自NADPH氧化酶的激活。
5.AngⅡ对胰岛β细胞中胰岛素信号通路的影响可能部分通过活化NADPH氧化酶导致氧化应激增加而介导。