抗生素的发现使很多细菌感染性疾病得以控制,但是,随着抗生素的广泛使用,尤其是滥用和误用,导致大量的耐药菌株出现,甚至出现了多重耐药菌株和超级耐药菌株。此外,无论是临床上还是养殖业,很多细菌生物被膜的形成更是加剧了耐药性的严重性。因此,阐明细菌生物被膜的耐药机制对解决耐药性具有重大意义。一直以来,迟钝爱德华氏菌是鱼类一种重要的致病菌,该菌生物被膜的形成造成鱼类慢性感染并引起巨大的经济损失,并且抗生素的长期使用导致其非常严重的耐药性,因此应对和解决迟钝爱德华氏菌的耐药性问题已刻不容缓。因此研究迟钝爱德华氏菌生物被膜状态下的耐药机制具有重要的理论意义和应用前景。本论文利用蛋白质组学与基因组学相关研究技术,分析迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda ATCC15947)生物被膜状态下适应性耐药和获得性耐药过程中蛋白质的变化进行,并且比较抗生素敏感株和土霉素传代耐药菌株的全基因组特征,探讨迟钝爱德华氏菌生物被膜下的耐药相关蛋白与基因。本研究首先采用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术,对生物被膜状态下迟钝爱德华氏菌土霉素耐药菌株(获得性耐药)和抗生素敏感菌株(对照)在土霉素胁迫下(适应性耐药)蛋白质组的变化进行分析。结果表明,在生物被膜状态下,适应性耐药共有281个蛋白发生差异表达,其中有193个下调表达,88个上调表达；获得性耐药中,共有70个蛋白变化,包括20个下调表达和50个上调表达。随后的生物信息学分析发现,在适应性耐药中多个外膜蛋白(OppA、 MalE、GlnH等)的表达下调,核糖体相关蛋白的表达上调,而与糖酵解途径、戊糖磷酸途径和TCA循环等产能代谢途径相关蛋白表达下调；在获得性耐药中,多个ATP依赖型转运蛋白(NikA、OppA、MalE等)的表达发生下降,RNA聚合酶相关蛋白表达上升。KEGG分析发现,细菌趋化作用减弱,RNA聚合酶活性增加,进而使翻译途径增强。本研究中利用q-PCR和Western blotting技术对差异蛋白中的部分差异蛋白进行进一步的验证。结果发现,核糖体、代谢途径相关酶以及ABC转运等相关基因相应的mRNA水平上的变化基本与蛋白质水平上一致；Western blotting分析表明PflB和PspB蛋白在生物被膜耐药中确实发生了变化,可能是生物被膜耐药相关蛋白。此外,由于在两种耐药行为中,细菌能量代谢途径都呈现下降趋势,因此对产能关键途径TCA循环中的两种重要酶进行了活性测定。测定结果显示,生物被膜耐药过程中琥珀酸脱氢酶(SDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(a-KGDH)的活性的确都明显下降,提示细菌可能通过下调胞内的能量代谢介导生物被膜耐药。此外,为了研究基因突变对细菌耐药的影响,本论文利用全基因组测序技术对土霉素耐药菌株和敏感菌株的基因组进行了重测序。分析比较结果表明,38个已知的基因,如pgm、ppsA、gplK、tolC等发生了突变,这些基因的位点突变可能参与了细菌耐药的过程。此外,还有8个蛋白在获得性耐药中表达水平发生变化,同时基因上也发生了突变(fliC, parB, accA等),提示这些基因的突变与获得性耐药可能有一定关系。综述所述,生物被膜状态下,迟钝爱德华氏菌可能通过以下方式介导细菌产生耐药：(1)一些外膜蛋白(OppA、MalE、GlnH等)的下调表达,降低细胞膜的通透性；(2)降低TCA循环等能量代谢途径；(3)增强翻译途径；(4)下调细菌的趋化作用：(5)一些酶和外膜蛋白相关基因的突变。这些耐药机制的发现,为解决生物被膜的耐药性提供新思路和有效候选靶标位点,对生物被膜感染性疾病的治疗具有重要意义。