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目的采用骨髓基质细胞HS-5与乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养来模拟肿瘤骨转移微环境，研究人类骨形态发生蛋白9(bone morphogeneticprotein9, BMP9)对骨微环境中乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学行为的影响及其可能分子机制。方法以高转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞株为研究对象，将其与骨髓基质细胞HS-5共培养构建乳腺癌骨转移微环境。采用重组腺病毒过表达及干扰两种途径研究BMP9对微环境中MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等肿瘤生物学行为的影响。首先，制备感染各种腺病毒的乳腺癌细胞，BMP9过表达细胞MDA-MB-231/AdBMP9及其对照MDA-MB-231/AdGFP，BMP9干扰细胞MDA-MB-231/AdsiBMP9及其对照MDA-MB-231/AdRFP，然后采用Transwell共培养体系将各组MDA-MB-231细胞与骨髓基质细胞HS-5共培养3d。其中，以MDA-MB-231+HS-5、 MDA-MB-231/AdGFP+HS-5、MDA-MB-231/AdRFP+HS-5、 MDA-MB-231/AdBMP9+HS-5、MDA-MB-231/AdsiBMP9+HS-5分别为空白组（Co-Blank）、GFP对照组（Co-GFP）、RFP对照组（Co-RFP）、BMP9过表达组（Co-BMP9）、BMP9干扰组（Co-siBMP9）。通过MTT实验检测BMP9对于共培养体系中MDA-MB-231细胞增殖能力的影响；划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测癌细胞迁移侵袭能力的变化；流式细胞术（FCM）检测癌细胞的凋亡情况；QRT-PCR检测共培养的两种细胞中转移相关因子白介素-6（IL-6）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达量的变化；明胶酶谱检测各组共培养体系中培养基所含有活性的基质金属蛋白酶（MMPs）的差异；免疫荧光检测乳腺癌MDA-MB-231细胞CXCR4受体的表达及EMT相关分子Vimentin、Fibronectin的变化；Western blot检测乳腺癌细胞EMT相关分子及SDF/CXCR4-PI3K信号通路关键分子的活化状态。取人骨关节置换术后新鲜的松质骨包埋于裸鼠背部皮下，一周后将骨髓基质细胞HS-5与各组乳腺癌MDA-MB-231细胞以1:1的比例混合紧贴植入骨接种于裸鼠皮下，进行皮下成瘤。观察瘤体生长情况，定期测瘤体体积。41天后处死裸鼠，取包埋骨及瘤体做组织切片，HE染色观察各组包埋骨骨小梁损害程度及瘤体分化情况；免疫组织化学染色检测观察瘤体中Vimentin、MMP2、SDF-1、CXCR4的表达情况；TUNEL凋亡染色检测瘤体中凋亡细胞的数目。结果构建了BMP9过表达乳腺癌细胞MDA-MB-231/AdBMP9，和干扰内源性BMP9表达乳腺癌细胞MDA-MB-231/AdsiBMP9，利用这2株细胞分别与人骨髓基质细胞HS-5共培养，从基因沉默及基因过表达正反两方面探索BMP9对处于骨微环境中乳腺癌细胞的作用：①MTT结果显示在共培养体系中，Co-BMP9组癌细胞增殖略减慢，而Co-siBMP9组乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖无变化；②划痕愈合实验检测微环境中癌细胞横向迁移能力，Co-BMP9组划痕愈合率为(46.33±2.87)%，较对照组(84.67±4.64)%显著降低(P＜0.05)，且Co-siBMP9组较其对照组升高(P＜0.05)；③Transwell迁移实验检测微环境中癌细胞纵向迁移能力，Co-BMP9组穿膜癌细胞数（161±3.2）显著低于对照组（215±15.1）(P＜0.05)，Co-siBMP9组与对照组无差异；④Transwell侵袭实验显示，Co-BMP9组侵袭穿膜癌细胞数（112±9.6）明显低于对照组（189±7.4）(P＜0.05)，且Co-siBMP9组侵袭穿膜癌细胞数（237±8.3）高于对照组（183±5.9）(P＜0.05)；⑤流式细胞术检测微环境中MDA-MB-231细胞凋亡，结果显示Co-BMP9组乳腺癌细胞凋亡率为（31.3±5.8）%，显著高于对照组（14.7±7.5）%，Co-siBMP9组凋亡率（6.5±1.8）%低于其对照组（15.6±6.3）%(P＜0.05)。BMP9对处于骨微环境中的乳腺癌MDA-MB-231细胞作用可能机制的探索：①共培养期间发现乳腺癌MDA-MB-231细胞形态变化明显，与对照组相比，Co-BMP9组乳腺癌细胞呈椭圆聚集状生长，而对照组及Co-siBMP9组癌细胞呈细长梭形分散状生长；②免疫荧光检测MDA-MB-231细胞EMT（Epithelial-mesenchymal transition，上皮-间质转化）相关分子Vimentin和Fibronectin，结果发现Co-BMP9组，MDA-MB-231细胞此两种间质标志物均显著降低，但Co-siBMP9组与对照组相比变化不明显；③明胶酶谱检测共培养体系培养液中有活性MMPs的含量，结果显示与对照组相比Co-BMP9组具有活性的MMP2和MMP9均减少，而Co-siBMP9组则有所升高；④QRT-PCR检测各组两种共培养细胞转移相关因子（IL-6，MCP-1，SDF-1）的表达情况：发现HS-5细胞中，Co-BMP9组三种因子均降低，与对照组差异显著(P＜0.05)，Co-siBMP9组仅SDF-1表达量高于其对照组(P＜0.05)；MDA-MB-231细胞中，Co-BMP9组SDF-1无变化(P＞0.05)，IL-6和MCP-1表达降低，Co-siBMP9组三种因子均无变化；⑤免疫荧光结果显示，MDA-MB-231细胞有SDF-1唯一受体CXCR4的表达；⑥Westernblot检测共培养体系中各组HS-5细胞SDF-1的表达情况，发现Co-BMP9组SDF-1的相对表达量比对照组降低（1.145±0.034）倍(P＜0.05)，Co-siBMP9组的相对表达量比其对照组高（0.872±0.049）倍(P＜0.05)，HS-5细胞上CXCR4受体表达量无变化，同时，检测共培养体系中各组MDA-MB-231细胞SDF-1及CXCR4表达量均无差异(P＞0.05)；Western blot检测共培养体系中各组MDA-MB-231细胞EMT及转移相关分子，结果显示间质标志物（Vimentin， Fibronectin）和转移相关因子（MMP2，MMP9）在Co-BMP9组显著降低，Co-siBMP9组有所升高：Co-BMP9组其表达量与对照组差异显著(P＜0.05)，降低程度分别为Vimentin（1.67±0.055）倍， Fibronectin（0.85±0.042）倍，MMP2（1.02±0.026）倍，MMP9（1.53±0.061）倍，Co-siBMP9组与其对照组相比有所升高，升高程度分别为Vimentin（1.32±0.025）倍，Fibronectin （0.79±0.012）倍， MMP2（0.56±0.014）倍， MMP9（1.93±0.072）倍；Western blot检测共培养体系中各组MDA-MB-231细胞SDF-1/CXCR4-PI3K下游信号通路激化情况：发现BMP9下调SDF-1配体后，通路下游Akt磷酸化明显降低，较对照组降低（0.96±0.025）倍(P＜0.05)， Co-siBMP9组较其对照组升高（0.87±0.018）倍，差异显著(P＜0.05)。裸鼠皮下紧贴包埋骨接种骨髓基质细胞HS-5与各组乳腺癌MDA-MB-231细胞混合悬液，制备体内微环境模型：①结果发现Co-BMP9组皮下瘤体体积（1605.12±8.9） mm3，较对照组（1836.02±10.7）mm3小，但无显著性差异(P＞0.05)，Co-siBMP9组瘤体较其对照组无差异(P＞0.05)；②留取瘤体及包埋骨，多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，行HE染色，瘤体染色无显著差异，包埋骨Co-BMP9组骨小梁损害较对照组少；③TUNEL染色发现，Co-BMP9组细胞凋亡率（79.5±1.6）%较对照组（37.8±1.2）%显著增多(P＜0.05)，Co-siBMP9组凋亡细胞较其对照组减少，无显著性差异(P＞0.05)；④瘤体切片行免疫组织化学染色，发现Co-BMP9组Vimentin、MMP2、SDF-1染色明显低于对照组，各组CXCR4染色强度无差异。结论在体内外模拟骨微环境中，BMP9可以调节乳腺癌细胞与骨髓基质细胞的相互作用，抑制高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭，并促进其凋亡。其可能机制为：①BMP9逆转乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT状态，下调活性MMPs；②BMP9抑制微环境中骨髓基质细胞HS-5分泌SDF-1，从而阻断两细胞间的SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路。