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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的严重危害养全球猪业的烈性传染病,在我国被列为一类动物疫病。20世纪50年代我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗株（Hog cholera lapinized virus,HCLV）亦称C株（Chinese strain,C strain）目前仍是世界公认的最安全和最有效的CSF疫苗。HCLV疫苗的广泛应用成功控制了我国CSF的大流行,但目前CSF仍呈散发状态,其中带毒母猪是重要的传染源,因此建立可鉴别疫苗免疫和野毒感染的血清学诊断方法对于实现CSF净化至关重要。虽然我国目前已经有商业化的能鉴别疫苗免疫和野毒感染的CSFV E2亚单位疫苗,但不能有效阻断垂直传播,而HCLV疫苗因其良好的免疫原性和安全性,在我国CSF净化中仍将发挥重要作用。然而,HCLV疫苗与CSFV流行毒株主要抗原糖蛋白E2和Erns蛋白的抗原性差异尚不清楚,因此,筛选鉴定能鉴别疫苗株和流行毒株的单抗以及广谱性单抗对于研发相应的血清学诊断方法非常关键。随着单克隆抗体技术的发展,大量的抗体应用到生命科学研究和临床诊断中,CSFV E2和Erns抗体也得到了长足的发展和应用,但目前针对HCLV疫苗与流行毒株差异抗原表位的单抗研究报道较少。本人硕士期间对3株CSFV E2蛋白单抗（N0.1:3H3G6、No.3:6B211、No.4:9A4H4）和1株HCLV-Erns蛋白单抗（N0.2:1104）进行了流行毒株的反应原性鉴定。其中3H3G6单抗为流行毒株特异而不与HCLV反应,6B211单抗与HCLV等基因1.1亚型疫苗株（6/6）和部分基因2.2亚型（8/12）毒株反应,与SM株等基因1.1亚型毒株反应较弱,而与其他流行毒株不反应;9A4H4单抗与SM株、HCLV以及大半的流行毒株（57/106）反应;1104单抗只与HCLV和Riems疫苗株反应,与其他毒株均不反应,因此3H3G6、6B211和1104单抗可鉴别CSFV流行毒株与HCLV疫苗;以上4株单抗均识别构象表位,但仅6B211单抗具有中和能力。在硕士工作基础上,本研究利用真核表达纯化的SM-E2蛋白免疫小鼠,经多轮筛选和亚克隆,又获得了9株稳定的杂交瘤细胞系。抗体亚型鉴定结果显示,HCL-002单抗为Ig A,其余均为Ig G1;HCL-005和HCL-007单抗的轻链为λ型,其余单抗的轻链均为κ型。抗体病毒反应谱鉴定结果显示,HCL-001、HCL-005和HCL-010单抗为广谱性单抗,与验证的CSFV毒株都能反应;HCL-002单抗与基因1型（4/4）、大部分基因2.1亚型（66/68）、基因2.2亚型（24/24）毒株反应,而与基因2.3亚型（0/12）以及一株基因3.1亚型毒株不反应;HCL-007和HCL-008单抗反应谱无明显规律;HCL-009单抗只与SM株、2株基因1.1亚型流行毒株以及3株疫苗株（HCLV-India、GPE-和Thiverval）反应,但与HCLV不反应,与之类似,HCL-018单抗只与SM株以及2株基因1.1亚型的流行毒株反应,但与其他毒株及疫苗株均不反应;HCL-014单抗与大部分流行毒株（104/108）反应,仅与基因2.1和2.3亚型各2株毒株不反应。同时对4株HCLV-Erns单抗（1204、1504、1904和2004）进行了验证,抗体亚型鉴定结果显示4株单抗均为Ig G1,抗体轻链均为κ型。反应谱鉴定结果显示,1204单抗为广谱抗体,能够与绝大部分验证用毒株反应,仅与HCLV-India-Erns和LPC-Erns不反应,而1504、1904和2004单抗的反应特性与前期鉴定的1104单抗类似,该3株单抗只与HCLV和Riems株反应,与其他毒株均不反应。中和实验表明本研究制备的SM-E2抗体中仅HCL-008不能中和SM株,HCL-007和HCL-014中和SM株能力较弱,其余单抗均能高效中和SM株;而4株HCLV-Erns单抗均不能中和HCLV;表位类型鉴定结果显示HCL-001、HCL-005和HCL-010单抗识别线性表位,其余SM-E2单抗及4株HCLV-Erns单抗均识别构象表位。为进一步解析抗体识别的抗原表位,本研究利用截短表达和置换重组方法初步鉴定了抗体识别表位所在区域,结合氨基酸序列比对分析和氨基酸点突变成功解析了部分单抗(SM-E2单抗:3H3G6、9A4H4、HCL-001、HCL-002、HCL-005、HCL-010,HCLV-E2单抗:6B211以及HCLV-Erns单抗:1104、1204、1504、1904和2004)识别的抗原表位。3H3G6单抗识别表位为213EPD215,6B211单抗识别表位为37LXLNDG42,9A4H4单抗识别表位为271RXGP274,HCL-001、HCL-005和HCL-010单抗识别表位为143SPT145,L147,HCL-002单抗识别表位为95GDD97,157RX（K/R）PXPXXR164,1104、1504、1904和2004单抗识别表位为100D,V107,1204单抗识别CSFV Erns蛋白保守表位38CKGVP42,W81;同时本研究重新鉴定了WH303单抗的表位为143SPT145,147LR148;其中6B211单抗识别的抗原表位关键位点N40是CSFV流行毒株逃逸HCLV疫苗免疫的相关位点之一。为探究本研究鉴定的单抗识别表位在临床免疫或感染血清中诱导产生抗体的情况,发掘单抗在临床中的应用潜力。结合抗体反应特性鉴定结果,本研究选择了3株广谱性单抗HCL-001、HCL-002和1204以及2株鉴别单抗3H3G6和1104,实验利用ELISA初步鉴定不同临床血清对这5株单抗的阻断作用,结果发现阴性血清和CSFV感染血清均不能有效阻断以上5种单抗;HCLV疫苗免疫血清能够有效阻断HCL-001、HCL-002、1104和1204单抗,其中对HCL-002单抗的阻断作用最为显著,但几乎不能阻断3H3G6单抗;而疫苗免疫后感染血清均能显著阻断以上5种抗体;因此3H3G6单抗可用于建立区别HCLV疫苗免疫后流行毒株感染的血清学鉴别方法,HCL-002单抗可用于评价HCLV疫苗免疫效果。本研究初步解析了HCLV疫苗株与CSFV流行毒株E2和Erns蛋白中的差异表位和保守表位,并鉴定了一处CSFV免疫逃逸相关突变位点,对CSFV主要糖蛋白的抗原结构及流行毒株免疫逃逸的分子机制提供了新见解,为未来CSF疫苗优化以及鉴别诊断方法的建立提供了新思路,以鉴别单抗和广谱性中和单抗为基础建立的鉴别诊断方法以及免疫效果评价方法将为我国CSF的防控与净化提供科技支持。