前言肺癌现为全球肿瘤发病率里排行第二,死亡率排行第一的疾病。虽然肺癌的治疗方法和手段已取得了很大进步,但是其复发率与死亡率仍然居高不下。肺癌的研究因缺乏一个有效的体外模型而导致研究进展有限。如今,2D细胞系模型和人源异种移植动物模型（Patient-derived xenografts,PDX）已成为肺癌研究模型的金标准。2D细胞系模型因其低成本、简单快速的特点在实验研究中广泛应用。但是2D细胞系模型仅仅只能代表肿瘤其中的一种亚群,并且在长期的体外2D平面生长增殖过程中,肿瘤细胞缺少体内生长的环境,导致很难保持体内原始肿瘤的一些生物学功能。PDX动物模型相比于2D细胞系模型更加接近人体真实的肿瘤生长微环境,保证细胞的基因表达和表型。但是人源异种移植动物模型的费用高昂且时间成本效率低下,导致其应用也受到限制。鉴于上述,本研究拟通过3D生物打印技术,探讨构建一个3D肺癌体外模型,除肿瘤细胞外,同时关注肿瘤细胞的生长微环境。使构建的3D肺癌体外模型更加适用于抗肿瘤药物的研发和筛选,为肿瘤患者的个性化治疗提供一个更优秀的验证平台。第一部分基于3D生物打印技术和RNA测序技术的肺癌体外模型研究目的:通过3D生物打印技术构建一个肺癌的体外模型,评估肺癌体外模型的可行性。通过转录组测序来对比2D及3D的肺癌细胞的差异基因及功能富集。方法:1.使用非小细胞肺癌细胞系的A549细胞与海藻酸钠/明胶/纤维蛋白原混合,当作3D打印的生物墨构建肺癌体外模型的水凝胶支架,使用氯化钙（Ca Cl2）/谷氨酰胺转胺酶（TGase）/凝血酶作为交联剂。其中Ca Cl2用于交联海藻酸钠,谷氨酰胺转胺酶用于交联明胶,凝血酶用于交联纤维蛋白原。2.使用迈普医学生产的多喷头3D生物打印机(Liv PrintTM)进行本实验的3D打印生物打印。将3D生物打印机装载含有A549细胞的海藻酸钠/明胶/纤维蛋白原生物墨水,通过电脑设定预定的打印路线,利用挤出式打印机打印出一个50×50mm的纵横交错的网格状水凝胶支架。支架打印在预冷的平台上,3D生物打印机打出的温敏材料在接触的温度低的平台会进行一个简单的成型,此时的水凝胶支架尚不牢固,随后通过Ca Cl2/TGase/凝血酶交联水凝胶支架后,使其形成一个稳定的可供A549细胞生长的3D空间多级孔的肿瘤模型。3.对打印并交联完成后的体外肿瘤模型进行后续研究,使用显微镜及电子显微镜对3D体外肺癌肿瘤模型进行观察。对肺癌体外肿瘤模型进行生物学评价,使用活/死试剂检测打印后模型内A549细胞的活死率。使用阿尔玛兰（Alamar Blue）测定肺癌体外肿瘤模型增值能力测定。4.收集2D及3D体外肿瘤模型培养的A549细胞,通过转入组测序对其进行生物信息学分析。结果:1.通过3D生物打印技术,使用海藻酸钠/明胶/纤维蛋白原体系作为生物墨水,打印出的体外肺癌肿瘤模型为适宜A549细胞生存的多孔级结构模型。通过光学显微镜、电子显微镜及HE染色等实验观察发现,3D模型比2D细胞系模型相比更加接近人体真实的生长环境。2.生长第15天时,2D组内A549细胞的存活率为91.10%±1.3%,3D肺癌体外模型内的A549细胞存活率为89.76±2.3%,2D与3D组在细胞存活率方面无明显差别,P＞0.05,无统计学差异。3.在细胞增殖率测定中,发现在2D组的细胞在前5天生长速率极快,而在5天之后,增长速率放缓;细胞培养至第9天以后,细胞增殖出现一个下降的过程。而在3D组细胞在一开始一直处于缓慢的生长过程,在第12天时增长率处于一个顶峰,随后增长率出现一个下降的趋势。Alamar Blue测定2D组与3D组第15天的相对增殖率,与第1天细胞相比,培养至第18天时3D组细胞增长了1.82倍,2D组细胞增长了1.31倍,P＜0.05,具有统计学差异4.通过转录组测序对比2D和3D体外肺癌模型的A549细胞,以p值≤0.05,|Log2Ratio|≥1为筛选条件,具有差异表达基因共3112个,其中上调基因1189个,下调基因1923个。对差异基因进行功能富集分析后,这些差异基因影响了A549细胞的生物学的调控,从而促进了肺癌的进展。结论:本部分的研究通过使用3D生物打印技术,构建出可以持续性生长的肺癌体外肿瘤模型。通过观察,该体外模型与2D模型相比,更加接近真实的人体肿瘤生长环境。3D肺癌体外模型中A549的存活率与2D组无明显差别。肺癌体外模型内A549的增殖率并未因生长环境的改变而下降明显。转录组测序结果显示2D与3D肺癌模型中,两种环境下培养的A549细胞基因表达量存在差异,并且具有各自特征的基因表达谱。通过富集分析发现差异基因与细胞周期、NF-KAPPA-B、PI3K-AKT等信号通路相关。证明3D的生长环境促进了肺癌细胞的发展。3D生物打印为研究肺癌肿瘤微环境的机制及抗癌的药物筛查可能提供一个新的研究平台。第二部分同轴3D生物打印构建肺癌体外模型目的:使用同轴3D生物打印技术构建壳/芯肺癌体外模型,评估该模型培养A549细胞的可行性,同时对比2D模型与同轴打印的3D模型中A549细胞的生物功能及耐药性差异,为后续细胞-细胞之间相互作用研究提供基础。方法:1.使用3D生物打印机构建壳/芯水凝胶构建肺癌体外模型,采用特制同轴打印针头可打印出两条单独的通道,芯通道中包含肿瘤细胞悬液/Ca2+,壳通道采用的材料是海藻酸钠/明胶。在打印初期,两条通道水凝胶接触在一起之后,在芯通道中Ca2+与壳通道中的海藻酸钠立即交联,在两条通道之间形成一道交联壁,芯内细胞可在内轴中自由通行。打印结束后,使用Ca Cl2将水凝胶整体交联,使得整个体外肺癌模型变得稳定牢固,完成壳/芯A549水凝胶支架。2.使用光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、HE染色观察该肺癌体模型,使用活/死试剂检测打印后细胞整体存活率,使用Alamar Blue检测打印之后整体的增值能力及化疗药物顺铂处理后的耐药性测定。使用细胞划痕实验,Transwell实验检测肺癌体外模型的侵袭与迁移能力。结果:1.同轴3D生物打印可以构建壳/芯肺癌体外模型。在该模型中细胞可以在芯内通道的3D环境中进行自由的生长,同时在外壳中形成多孔级网状结构,与外界培养基可以交换营养物质及释放代谢物。2.同轴3D组与2D组中A549细胞通过活/死检测,发现在培养第10天时3D组细胞的存活率在86.6±2.3%,2D组细胞的存活率为91.77±3.2%,2组细胞存活率无明显差异,P＞0.05,无统计学差异。3.同轴打印的体外模型后第1天,细胞在水凝胶内轴呈单个的散在存在。第3天,细胞出现自主装成团聚集。而培养到第10天时,壳-芯水凝胶支架仍然完好无损,细胞填满整个内轴。Alamar Blue测定2D组与3D组第7天的相对增殖率,与第1天细胞相比,培养至第7天时3D组细胞增长了2.34倍,2D组细胞增长了2.13倍,P＜0.05,具有统计学差异。4.同轴3D打印肺癌模型中A549细胞更加耐受药物处理。经过32ug/ml的DDP处理48h之后,2D组的细胞相对存活率为7.92±3.2%,3D组的细胞相对存活率为19.54±2.7%,P＜0.05,具有统计学差异。5.同轴3D组与2D组细胞在在划痕实验中,3D组的相对迁移距离为0.374,2D组的相对迁移距离为0.217,P＜0.05,具有统计学差异;在Transwell迁移实验中,3D组迁移的细胞数量为1104个,2D组为524个,P＜0.05,具有统计学差异;在Transwell侵袭实验中,3D组穿透小室的细胞数量为942个,2D组为349个,P＜0.05,具有统计学差异。结论:本部分研究通过同轴3D生物打印出壳/芯水凝胶支架是一种优秀且稳定的体外肺癌肿瘤模型,在该模型下培养的A549细胞的存活率及增殖能力良好。与2D组相比,同轴打印的壳/芯A549水凝胶支架中A549细胞的活性及增殖无明显的差异。同轴3D组与2D组相比,A549细胞具有更强在侵袭及迁移能力,并且具有更强的耐药性。同时同轴3D生物打印出的肺癌体外模型可能作为新的筛药平台使用。第三部分同轴3D生物打印研究肺癌细胞与间充质干细胞之间的相互作用目的:本部分的研究使用同轴3D生物打印技术,构建一个壳MSC/芯A549的肺癌体外模型,模拟体内肺癌肿瘤微环境,研究3D肺癌体外模型中A549细胞致瘤性,以及了解肺癌体外模型中A549与MSC之间的相互作用的机制。方法:1.使用明胶/海藻酸钠为原料,使用同轴3D生物打印技术构建壳MSC/芯A549水凝胶支架。2.通过qPCR对2D-A549、壳/芯A549和壳MSC/芯A549模型中的A549细胞进行检测,检测其与A549细胞干性有关的CD44,CD133,SOX2和NANOG相对表达量,与EMT相关的N-Cadherin,E-Cadherin,fibronectin,Twist1和Snail1相对表达量,与细胞侵袭有关的MMP2和MMP9相对表达量。3.制备2D-A549和3D-MSC共培养的条件培养基（Conditioned medium,CM1）和A549/MSC的条件培养基（CM2）分别培养肺癌体外肿瘤模型,收集A549细胞,使用qPCR对其进行致瘤性评价。4.使用qPCR检测2D-MSC、3D-MSC和壳MSC/芯A549中MSC细胞的IL-10、TGF-β1和CXCL12经典的肿瘤增强子的表达水平。5.通过裸鼠异移植瘤模型验证肺癌体外模型中A549细胞致瘤能力。结果:1.同轴打印可以构建壳MSC/芯A549体外肺癌肿瘤模型,通过此模型可以作为研究细胞与细胞之间相互作用的新的平台。2.qPCR检测同轴打印的壳MSC/芯A549模型中A549的细胞干性。结果显示,与第5天的2D-A549组相比,第15天的壳/芯A549模型中A549细胞的CD44、CD133、SOX2、NANOG相对表达分别为4.8、3.8、3.1、14.7倍。第15天的壳MSC/芯A549模型中A549细胞的CD44、CD133、SOX2、NANOG相对表达分别为5.1、5.3、3.4、18.7倍;以上所有P＜0.05,具有统计学差异。3.qPCR检测同轴打印的壳MSC/芯A549模型中A549的EMT标志物。结果显示,与第5天的2D-A549组相比,第15天的壳/芯A549模型中A549细胞的N-cadherin、E-cadherin、Fibronectin相对表达分别为4.8倍、0.23倍、5.5倍,P＜0.05,具有统计学差异;Snail1和Twist1的相对表达无明显变化。第15天的壳MSC/芯A549模型中A549细胞的N-cadherin、E-cadherin、Fibronectin、Snail1和Twist1的相对表达分别为5.1倍、0.20倍、6.2倍、4.9倍和5.8倍,P＜0.05,具有统计学差异。4.qPCR检测同轴打印的壳MSC/芯A549模型中A549细胞的迁移能力标志物。结果显示,与第5天的2D-A549组相比,第15天的壳/芯A549的MMP2、MMP9的相对表达分别为3.1、2.7倍。第15天的壳MSC/芯A549的MMP2、MMP9的相对表达分别为5.7、5.8倍。以上所有P＜0.05,具有统计学差异。5.使用条件培养基处理壳/芯A549细胞之后,发现壳/芯A549细胞的致瘤能力有所增强。与2D-A549相比,未用条件培养基处理的MSC/芯A549的MMP9、CD133、NANOG的相对表达量分别为10.2、3.21、4.45倍,CM1处理之后相对表达分别为13.3、3.9、10.8倍;CM2处理之后相对表达分别为13.6、4.5、11.6倍。以上所有P＜0.05,具有统计学差异。6.qPCR检测3D模型中的MSC的经典肿瘤增强因子IL-10、TGF-β1和CXCL12的表达,结果显示,2D-MSC相比,3D-MSC中IL-10、TGF-β1和CXCL12的相对表达分别为7.5、3.3、3.5倍;壳MSC/芯A549中的MSC细胞IL-10、TGF-β1和CXCL12的相对表达分别为7.96、3、4.3倍。以上所有P＜0.05,具有统计学差异。7.壳MSC/芯A549、壳/芯A549模型中的A549细胞与2D相比,致瘤能力更强。在第24天,2D组移植瘤体积为255.3mm3,壳/芯-A549组移植瘤体积为585.4 mm3,壳MSC/芯A549组移植瘤体积为661.071 mm3。P＜0.05,具有统计学差异。结论:通过同轴3D生物打印的体外肺癌模型作为研究平台,证实肺癌细胞与MSC细胞相互作用之后的具有更强的致瘤性。A549与MSC相互作用下产生肿瘤增强剂分泌在培养基中,从而增强肺癌的致瘤能力。裸鼠移植瘤模型也验证了共培养之后的A549细胞更加具有致瘤性。结论1.本研究通过3D生物打印技术构建肺癌体外模型,探索并确认3D生物打印构建肺癌体外模型的可行性,同时使用转录组测序技术对比2D与3D组细胞之间的基因表达量的差异,将差异基因进行功能富集发现3D环境能促进肺癌的进展。2.通过同轴3D生物打印技术构建壳/芯A549模型,与2D组细胞相比,壳/芯A549模型中的A549细胞具有更强的侵袭与迁移能力。同时可作为细胞-细胞之间相互作用的新型研究平台。3.通过同轴打印技术构建细胞-细胞相互作用的壳MSC/芯A549体外模型,证实A549与MSC发生相互作用之后具有更强的致瘤能力。同轴打印的壳/芯水凝胶模型不仅可以模拟3D肺癌微环境,同时也可以为研究细胞-细胞之间的相互作用机制提供平台。