背景与目的:胃癌是全球第五大最常见的恶性肿瘤,5年生存率不到20%。多数胃癌患者被发现时已经到达晚期,化疗仍是转移性胃癌治疗的基本手段。除了少数Her-2阳性患者可以使用赫赛汀治疗,多数患者目前缺乏有效的靶向药物。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）是TNF超级家族（TNFSF）的成员。TRAIL结合TRAIL的两个受体（DR4,DR5）可以转移细胞外死亡信号,是癌症治疗的一种新型生物疗法。因对肿瘤特异性高而对正常组织低毒性而受到了广泛关注。但临床应用还是遇到了阻碍,多数胃癌患者对TRAIL具有耐药性,且机制并不明确。故揭示TRAIL耐药的机制对胃癌的治疗具有突破性意义。Micro RNA是保守性良好的非编码小RNA,它通过结合m RNA的3’-非编码区（UTR）来降解m RNA,参与了多种肿瘤细胞TRAIL耐药生理过程。然而,不确定何种Micro RNA与TRAIL耐药相关,筛选出与TRAIL耐药相关的micro RNA,并确定其下游靶点基因,对提高胃癌细胞对TRAIL敏感性具有极其重要的意义。既往对PD-L1的研究大多集中在免疫抑制和免疫治疗方面。但最近的研究表示,PD-L1本身在肿瘤细胞内部参与了恶性表型（如EMT和肿瘤干细胞）并产生化疗耐药。最近的研究表明,TRAIL诱导EGFR激活,并导致胃癌细胞对TRAIL耐药。我们在本项研究中,围绕miRNA/PD-L1/EGFR活化这三者的相互作用进行探讨,确定EGFR活化并导致TRAIL耐药的机制。这项研究为PD-L1抑制剂和TRAIL在胃癌的联合用药提供了新的理论基础,同时也为筛选TRAIL敏感患者提供了参考指标。研究方法:1.细胞培养:BGC823,SGC7901,HGC27和MKN45胃癌细胞系从上海中国科学院购买?所有细胞系培养在含10%胎牛血清和1%青/链霉素的RPMI 1640培养基中,饲养在5%CO2,37摄氏度的孵箱中。2.Micro RNA芯片分析miRNA微阵列芯片购买于Affymetrix,Thermo Fisher Scientific,用于筛选TRAIL敏感和耐药两种细胞（MKN45与BGC823）中差异表达的miRNA。芯片结果已经上传公共数据库。3.细胞转染:两条靶点为PD-L1的独立序列的si RNA,miR-429的模拟物,miR-429的抑制剂、PD-L1的c DNA质粒载体用于转染。Lipo3000被用于转染实验。4.生物信息学分析使用GEPIA,starbase,kmpolt,UCSC genome网站,调用TCGA胃癌数据集对基因在胃癌和正常组织的差异表达进行分析,micro RNA的结合靶点进行预测?5.流式检测细胞凋亡AnnexinⅤ和PI染色细胞?使用BD LSRFortessa流式细胞仪采集染色细胞。使用Flow JⅩ分析流式细胞数据并作图。6.Western bolt提蛋白,蛋白定量,电泳,转膜,牛奶封闭,孵育一抗,孵育HRP二抗,发光仪发光为WB步骤?Image J软件对WB条带进行量化分析?7.免疫荧光多聚甲醛固定,Trion-X100通透,BSA封闭,一抗,荧光二抗,DAPI染色为免疫荧光步骤。最后在荧光显微镜观察并拍照。8.RT-PCR:使用RNA提取试剂盒提取总RNA?根据茎环法设计的引物用于micro RNA的c DNA的反转录和定量分析?m RNA的第一链c DNA使用反转录试剂盒获得?使用RT-PCR定量试剂盒对c DNA进行定量分析?使用actin作为内参进行相对定量?2–ΔΔCT相对定量方法用于量化分析。9.蛋白质免疫共沉淀.取转染细胞且经过TRAIL处理后,使用抗PD-L1、EGFR抗体和免疫球蛋白-A/G糖珠孵育细胞裂解液,提取PD-L1和EGFR结合蛋白复合物,使用对应指标抗体进行蛋白质印迹分析?10.细胞活力测定TRAIL处理转染后的细胞,根据说明书使用试剂盒（Promega,G7570）检测细胞活力并绘制成曲线?11.TUNEL使用TUNEL试剂盒,根据说明书,转染后的细胞经TRAIL处理,多聚甲醛固定,Triton X-100通透,避光3%H2O2封闭,TUNEL溶液孵育?DAPI用于染核?在荧光显微镜观察样品并取图?12.双荧光素酶报告实验构建野生型及突变型PD-L1（3’-UTR）荧光素酶质粒载体?同时转染micmiR-429,两种荧光素酶质粒载体,海参荧光素酶质粒载体,48小时后检测荧光强度数据并进行数据分析?13.统计每次实验进行三次,数据结果为三次平均值±标准差（n=3）,使用双尾t检验进行组间比较。3.结果1.筛选出与胃癌细胞对TRAIL敏感性相关的miR-429流式细胞仪检测确定了TRAIL处理后四种胃癌细胞系的凋亡情况。发现BGC823和SGC7901对TRAIL耐药,而HGC27和MKN45对TRAIL敏感。Micro RNA芯片筛选,取差异表达量最大的miR-429在四种胃癌细胞中用RT-PCR验证。miR-429在敏感细胞中明显高表达,在耐药细胞中明显低表达。2.miR-429表达与胃癌细胞对TRAIL的敏感性正相关。转染miR-429抑制剂使敏感细胞中miR-429的表达降低约70%,给予TRAIL处理后细胞凋亡比例下降。miR-429的沉默降低了HGC27和MKN45对TRAIL的敏感性。转染miR-429模拟物使耐药细胞中miR-429显著过表达,给予TRAIL处理后细胞凋亡比例提高。miR-429的过表达增加了BGC823和SGC7901对TRAIL的敏感性。3.筛选miR-429下游靶点基因——PD-L1网站筛选miR-429下游保守靶点,PD-L1显示是miR-429的保守靶点之一。PDL1在敏感和耐药细胞中的表达量有明显差异,在耐药细胞中高表达,敏感细胞中低表达。在耐药细胞中沉默PD-L1,显著增加胃癌细胞对TRAIL的敏感性。4.miR-429通过结合PD-L1 m RNA的3’-UTR而下调其表达在SGC7901和HGC27中分别转染mimic-429和inhibitor-429,双荧光素酶报告基因实验、RT-PCR、western bolt和免疫荧光检测PD-L1表达水平变化,发现转染mimic-429后PD-L1表达下降,转染inhibitor-429后PD-L1表达上升。5.miR-429通过调节PD-L1的表达影响TRAIL的敏感性。在耐药细胞中用si RNA沉默PD-L1表达,TRAIL处理后TUNEL、流式细胞仪、western bolt检测细胞凋亡情况。结果显示,耐药细胞的PD-L1沉默后对TRAIL的敏感性明显提高。挽救miR-429过表达的耐药细胞中下调的PD-L1的表达,可恢复耐药细胞的耐药性。6.PD-L1通过结合EGFR并参与其磷酸化而激活增殖通路发挥抗凋亡作用免疫共沉淀结果显示,在耐药细胞中沉默PD-L1后,与PD-L1结合的总EGFR没有明显改变,而磷酸化EGFR明显减少,同时下游增殖通路活化减弱。在敏感细胞中过表达PD-L1,与PD-L1结合的总EGFR同样无改变,而磷酸化EGFG明显上升,同时促进下游增殖通路活化。细胞活力实验显示,PD-L1的表达对维持TRAIL处理后的细胞活力具有决定作用。4.结论miR-429在对TRAIL耐药和敏感的胃癌细胞中差异表达最大,miR-429的表达与胃癌细胞对TRAIL的敏感性呈正相关;miR-429负向调控PD-L1的表达,PD-L1的表达与胃癌细胞对TRAIL的敏感性呈负相关;PD-L1参与了TRAIL诱导EGFR活化的过程,并激活了增殖通路;miR-429/PD-L1通过活化EGFR,激活增殖通路导致胃癌细胞对TRAIL耐药。