还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其磷酸酯NADPH在许多生物催化过程中作为辅酶发挥着重要的作用。到目前为止,人们在检测生物体内NAD（P）H水平方面做了许多努力,以了解NAD（P）H在生物系统中的作用。其中荧光法相比于其他检测技术具有高的灵敏度、优异的选择性、非侵入式以及具有空间分辨率的可视化细胞成像能力等优点而受到生物成像应用的关注。但是猝灭型和荧光增强型荧光探针容易受到探针浓度,仪器效率,环境条件以及光漂白等因素的干扰,而比率型荧光探针可以消除大部分干扰。因此,比率荧光探针相对于强度型探针更适合于生物分子的荧光成像。目前,对于检测NAD（P）H的荧光探针的设计策略主要基于NAD（P）H和探针之间的氧化还原反应,同时伴随着探针的荧光强度或波长的改变。因此,基于这些策略,本论文首次报道了一种用于检测NAD（P）H的比率型有机小分子荧光探针,并将其成功应用于活细胞内NAD（P）H的比率荧光成像。本论文的具体研究内容如下:首先,根据NAD（P）H具有强还原性,其可以选择性亲核加成到特定的菁染料基团上,我们以此为出发点设计合成了一种基于香豆素和菁染料的有机小分子荧光探针Cou-In。随后,在室温条件下探究了该探针在溶液体系中的光谱性能,发现探针Cou-In在短波长与长波长处的荧光强度比值和NADH浓度之间呈现良好的线性关系:I₅₅₀/I₆₇₅=0.22027×[NADH]+1.24914,线性相关系数为0.9984,检测限为60nM。并且该探针合成操作简单,对NADH的比率响应具有选择性好、灵敏度高等优点。其次,为了研究探针Cou-In的生物应用价值,我们结合激光共聚焦显微成像技术,成功将探针应用于活细胞中NADH的可视化比率原位成像。而且我们还发现活细胞内存在的其他还原性物质、金属离子等对NADH的检测也不产生干扰。同时该探针表现出生物相容性好,低毒性等优点。最后,为了研究该探针是否可以用于检测NADH依赖酶的活性,我们选择乙醇脱氢酶（ADH）作为分析物,相关实验结果表明该探针可以实时检测酶的活性。