五味子不同制备工艺降酶提取物谱效学研究

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论文以五味子不同工艺的提取物为研究对象,构建不同工艺的五味子指纹图谱,并开展降酶药效学研究,获得指纹图谱的量化特征和药效学数据,用灰关联度分析方法,计算指纹图谱特征峰与药效间的关联度,以关联度的大小来衡量指纹特征对药效贡献的大小,最终确定哪些特征峰可以反映其药效。论文研究取得以下几方面的成果:i)建立了同时检测五味子中6种指标成分含量的HPLC分析方法:采用HPLC法对五味子指标成分五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素、乙素、丙素进行含量测定,所建立的方法准确、操作简便,可用于检测五味子中6种指标成分的含量。ii)五味子不同工艺指纹图谱的构建及模式分类研究:采用HPLC法对不同工艺(不同提取方法:回流、超声、超临界CO2;不同溶剂:乙醇、甲醇、乙酸乙酯;乙醇不同浓度:90%乙醇、60%乙醇;去或不去果肉)制备的五味子7种制备工艺的样品进行了分析,构建了五味子不同工艺HPLC指纹图谱,指纹图谱中共有峰13个,相似度达0.9以上,其中6个标示峰分别为醇甲、醇乙、酯甲、甲素、乙素和丙素。用系统聚类分析法的指纹特征(色谱峰峰面积)进行了聚类分析;系统将7个样品分为3组:90%乙醇、60%乙醇、甲醇回流提取制备的样品为一组,90%乙醇超声提取、乙酸乙酯回流提取、CO2超临界萃取制备的样品为一组,不去果肉直接用90%乙醇回流提取制备的样品为一组。iii)五味子的指纹图谱特征与药效关系的研究:从细胞和整体水平观察了不同工艺五味子提取物对CCl4诱导肝细胞损伤的保护作用。在培养的L-02人正常肝细胞,CCl4能显著诱导培养液谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量显著增加,而同时分别孵育不同工艺五味子提取物能不同程度的减少CCl4诱导的脂质过氧化和肝细胞损伤;在CCl4诱导的急性Wistar大鼠肝细胞损伤模型,血浆AST和ALT活性显著增加,病理切片显示肝组织广泛坏死、炎性细胞浸润,而灌胃给予不同工艺五味子提取物治疗后,血浆AST和ALT活性均有不同程度下降、肝组织坏死和炎症浸润减少。采用灰关联度分析技术,寻找指纹图谱特征所代表的化学成分对药效贡献的大小。结果表明:五味子对CCl4诱导肝细胞损失的影响是其内“化学成分群”共同作用的结果。依据关联度的大小,确定各成分对“降低CCl4诱导肝细胞AST活性增加的影响”贡献的大小顺序为:乙素>醇甲>酯甲>醇乙>甲素>丙素;各成分对“降低CCl4诱导肝细胞ALT活性增加”贡献的大小顺序为:酯甲>乙素>醇甲>醇乙>甲素>丙素;各成分对“CCl4诱导肝细胞培养液MDA含量的影响”贡献的大小顺序为:乙素>醇甲>酯甲>醇乙>甲素>丙素。本研究表明:中药“有效组分群”对“药效”均有贡献,但每种成分贡献的大小不同。本研究的创新之处在于建立了衡量“有效组分群”指纹特征对药效贡献大小的方法。本研究具有理论意义和实用价值,同时对指纹图谱在中药产业的应用起到了示范作用。
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