第一部分Vaspin对TNF-α诱导的H9C2细胞损伤的影响及机制目的1.研究TNF-α对H9C2细胞损伤作用及其机制。2.研究vaspin对TNF-α诱导的H9C2细胞损伤的影响及机制。方法1.TNF-ɑ诱导H9C2细胞损伤模型的建立。探索不同时间TNF-ɑ对H9C2细胞的影响,实验分组:（1）Control组:正常（21%O₂、5%CO₂、74%N₂,37℃）条件培养H9C2细胞24 h;（2）TNF-ɑ4 h组:H9C2细胞培养基中加入TNF-α（20ng/ml）培养4 h;（3）TNF-ɑ12 h组:H9C2细胞培养基中加入TNF-α（20 ng/ml）培养12 h;（4）TNF-ɑ24 h组:H9C2细胞培养基中加入TNF-α（20 ng/ml）培养24 h;光学显微镜观察细胞形态学改变;Western blot观察各组LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表达相对变化。2.研究TNF-ɑ诱导的自噬和凋亡的因果关系,通过干预自噬观察细胞凋亡的变化。实验分组:（1）Control组:正常（21%O₂、5%CO₂、74%N₂,37℃）条件培养H9C2细胞24 h;（2）TNF-α组:H9C2细胞培养基中加入TNF-α（20 ng/ml）培养24 h;（3）TNF-α+雷帕霉素（rapamycin,Rap）组:H9C2细胞培养基中加入Rap（100 nm）预处理2 h,再加入TNF-α（20 ng/ml）培养24 h;（4）TNF-α+3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组:H9C2细胞培养基中加入3-MA（5 mm）预处理2 h,再加入TNF-α（20 ng/ml）培养24 h;光学显微镜观察细胞形态学改变;Western blot观察各组LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表达相对变化;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。3.研究vaspin对TNF-α诱导的H9C2细胞损伤的影响。实验分组:（1）Control组:正常（21%O₂、5%CO₂、74%N₂,37℃）条件培养H9C2细胞24 h;（2）Vaspin组:H9C2细胞培养基中加入vaspin（100 ng/ml）培养24 h;（3）TNF-α组:H9C2细胞培养基中加入TNF-α（20 ng/ml）培养24 h;（4）TNF-α+vaspin组:H9C2细胞培养基中加入vaspin（100 ng/ml）预处理2 h,再加入TNF-α（20 ng/ml）培养24 h;（5）TNF-α+vaspin+IGF-1组:H9C2细胞培养基中加入vaspin（100 ng/ml）预处理2 h,IGF-1（100 ng/ml）预处理3 h,再加入TNF-α（20 ng/ml）培养24 h;利用MTT检测和ATP检测评估细胞活性;Western blot观察各组LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2、p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR蛋白表达相对变化;电镜和MDC染色观察细胞自噬小体的数量变化;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果1.TNF-ɑ诱导H9C2细胞发生凋亡同时伴有自噬水平降低。光学显微镜显示,对照组H9C2细胞呈“长梭形”贴壁生长,TNF-α组细胞形态不规则,培养基上清中出现透亮的漂浮死细胞,且随诱导时间延长,漂浮细胞数目增多;与对照组相比,TNF-α诱导后,H9C2细胞内凋亡蛋白Bax的表达随时间逐渐上升,抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐下调（P<0.05）;Beclin-1蛋白表达随时间逐渐下降,而自噬底物P62蛋白表达逐渐上升,同时表示自噬流的LC3-II/LC3-I的比值随时间逐渐下降（P<0.05）;2.上调自噬抑制TNF-α诱导的H9C2细胞凋亡。相比TNF-α组,TNF-α+Rap组凋亡蛋白Bax表达下调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调（P<0.05）;而TNF-α+3-MA组凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调（P<0.05）;细胞流式实验显示:与Control组相比,TNF-α组细胞凋亡率增加（P<0.05）;与TNF-α组相比,TNF-α+Rap组细胞凋亡率减少,而TNF-α+3-MA组细胞凋亡率增加（P<0.05）;3.Vaspin抑制TNF-α诱导的H9C2细胞凋亡。相比TNF-α组,vaspin预处理使细胞活性明显增加,细胞内ATP含量明显增加,且浓度大于100 ng/ml差异具有显著统计学意义（P<0.01）;Western blot提示:相比TNF-α组,TNF-α+vaspin组Bax/Bcl-2比值显著下降（P<0.05）;细胞流式实验显示,与Control组相比,vaspin组细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）,而TNF-α组细胞凋亡率增加（P<0.05）;与TNF-α组相比,TNF-α+vaspin组细胞凋亡率减少（P<0.05）;4.Vaspin促进H9C2细胞自噬。相比Control组,vaspin组细胞Beclin-1蛋白表达上调,LC3-II/LC3-I比值上升（P<0.01）;而TNF-α组细胞Beclin-1蛋白表达下调,LC3-II/LC3-I比值下降（P<0.01）;相比TNF-α组,TNF-α+vaspin组细胞Beclin-1蛋白表达上调,且LC3-II/LC3-I比值上升（P<0.01）;透射电镜实验及MDC实验显示,相比Control组,vaspin组细胞内自噬体数目明显增多,而TNF-α组细胞内自噬小体数目减少（P<0.05）;相比TNF-α组,TNF-α+vaspin组细胞内自噬小体数目增多（P<0.05）;5.Vaspin通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进自噬减少细胞凋亡。相比Control组,vaspin组细胞LC3-II蛋白表达水平上调,LC3-I表达水平下调,LC3-II/LC3-I比值上升,p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值下降（P<0.01）而Bax/Bcl-2比值无明显变化（P>0.05）TNF-α组细胞LC3-II蛋白表达水平下调,p-AKT蛋白表达上调,LC3-II/LC3-I比值下降,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和Bax/Bcl-2比值上升（P<0.01）;相比TNF-α组,TNF-α+vaspin组LC3-II/LC3-I比值上升,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和Bax/Bcl-2比值下降（P<0.01）相比TNF-α+vaspin组,TNF-α+vaspin+IGF-1组LC3-II/LC3-I比值下降,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和Bax/Bcl-2比值上升（P<0.01）结论1.TNF-α可通过抑制自噬诱导H9C2细胞的凋亡。2.Vaspin通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进自噬减少细胞凋亡。第二部分Vaspin对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化及心功能的影响目的探讨vaspin对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化及心功能的影响。方法取10周雄性SD大鼠随机分为以下3组:（1）对照组:普通饲料饲养,腹腔注射生理盐水（0.5 ml/kg/day）;（2）DCM组:一次性腹腔注射链脲霉素（Streptozotocin,STZ）（60 mg/kg）制作糖尿病模型,2周后尾静脉采血检测血糖高于16.7 mmol/l表示糖尿病模型建模成功,模型成功后腹腔注射生理盐水（0.5 ml/kg/day）,继续喂养12周;（3）Vaspin组:糖尿病模型成功后腹腔注射vaspin（320 ng/kg/day）,继续喂养12周,进行以下实验:（1）实验前一天,应用心脏彩超测量各组大鼠左室舒张末径（LVIDd）、左室收缩末径（LVIDs）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）和E峰/A峰（Em/Am）变化并比较分析;（2）颈静脉窦采血检测各组大鼠血液中TNF-α的变化;（3）HE染色观察各组大鼠心肌组织结构变化;（4）Masson染色检测各组大鼠心肌胶原纤维含量并分析胶原容积分数;（5）Western blot测定各组大鼠心肌组织中LC3、Beclin-1、P62、Bax、Bcl-2、TGF-β1、Collagen I蛋白表达相对变化。结果:1.相比Control组,DCM组体重降低,空腹血糖升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;相比DCM组,vaspin组体重增加,空腹血糖降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;2.相比Control组,DCM组TNF-α升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;相比DCM组,vaspin组TNF-α无显著变化（P>0.05）;3.相比Control组,DCM组LVEF、FS、Em/Am降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;相比DCM组,vaspin组LVEF、FS、Em/Am升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;4.相比Control组,DCM组LC3-II/LC3-I、Bcelin-1表达水平降低,P62、Bax/Bcl-2表达水平升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;相比DCM组,vaspin组LC3-II/LC3-I、Bcelin-1升高,P62、Bax/Bcl-2表达水平降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;5.HE染色显示,DCM组心肌结构排列紊乱,vaspin处理后明显改善;Masson染色显示,相比于DCM组,vaspin组心肌胶原容积分数减小（P<0.05）;Western blot提示vaspin能减少I型胶原蛋白的表达（P<0.01）,而对TGF-β1的表达无明显影响（P>0.05）。结论Vaspin可增加糖尿病心肌病大鼠心肌组织中的自噬水平,抑制心肌纤维化及改善糖尿病心肌病大鼠的心功能。