小油桐开花控制基因FT/TFL1的克隆及功能初步分析

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FT(flowering locus T)/TFL1(terminal flowering1)家族是一类能编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)的基因,在很多植物中被证明参与光周期调控植物开花的过程。但是在木本植物中这类基因的研究还较少。本研究的材料小油桐(Jatropha curcas L.),属于大戟科的多年生灌木或小乔木,是一种被广泛认可的优良能源植物树种。但是目前由于小油桐花期不集中、雌花比例较少以及营养生长期时间较长,导致其产量还不能满足快速发展的生物柴油产业的需求,所以如何提高小油桐的产量是亟待解决的问题。本研究旨在通过研究小油桐开花控制基因FT/TFL1的功能,明确小油桐的开花机理,以期找到调控小油桐开花习性的关键基因,为进一步的遗传改良和优良品种培育奠定基础。同时,也为木本植物开花的分子调控机制的研究提供新的实验数据。   本研究通过对已克隆的双子叶植物中的FT/TFL1家族基因序列进行比对,在同源性较高的序列区域设计简并引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)、cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)和染色体步移技术(genome walking)克隆获得了小油桐FT/TFL1家族的5个成员,分别命名为JcMFT(mother of FT and TFL1),JcFT,JcTFL1,JcTFL2和JcTFL3。通过BLAST分析发现小油桐FT/TFL1基因家族中的5个成员与其他植物的FT/TFL1基因家族成员的序列同源性可高达79%~90%。基因结构分析表明5个基因结构较保守,都具有4个外显子和3个内含子,并且中间两个内含子的碱基数目很保守,分别为41bp和62bp,这与其它研究报道相符。对这5个基因的推导氨基酸序列进行比对发现,它们相互间同源性较高,其中JcTFL1与JcTFL2同源性最高,可达77%。系统进化树分析结果显示,JcFT/TFL1分属于3个亚类,即JcMFT属于MFT-亚类,JcFT属于FT-亚类,JcTFL1,JcTFL2和JcTFL3都属于TFL-亚类。同时,将推导的氨基酸序列与拟南芥FT/TFL1序列进行比较,结果表明拟南芥FT-亚类、TFL-亚类和MFT-亚类中对功能起关键作用的保守氨基酸位点或区域在小油桐FT/TFL1中都能对应地找到。   为了研究JcFT/TFL1基因家族在小油桐中的功能,我们分别分析了这5个基因的时空表达模式。取幼苗植株、成年植株开花前期、开花期以及结果期的小油桐不同组织器官为材料,通过半定量反转录RCR(reverse transcriptionPCR,RT-PCR)方法分析了不同基因在不同发育阶段以及不同组织中的表达情况。结果显示,JcMFT主要在种子中表达,少量在根中表达;JcFT除了在成年植株开花前期中无表达外,在其它发育阶段植株的各个组织中都有表达,并且在结果期植株的茎顶端中达到最高表达量;JcTFL1和JcTFL3主要在幼苗和未开花植株中的根中表达,其它组织中几乎没有表达;JcTFL2的表达组织与JcFT类似,其最高表达量也出现在结果期植株的茎顶端中。同时,本研究通过染色体步移方法克隆出了JcMFT的启动子序列,对其启动子序列中顺式作用元件分析发现,该启动子中含有种子特异性表达元件RY repeat motif(CATGCAT)和EBOX(CANNTG),这与半定量RT-PCR分析发现的JcMFT在种子中大量表达结果相一致。为了进一步明确小油桐JcFT/TFL1家族的功能,本研究构建了这5个成员的植物超量表达载体,然后通过花浸泡法转化模式植物拟南芥。通过卡那霉素抗性培养基筛选及PCR鉴定获得T0代转基因植株,其中获得JcMFT转基因植株19株,JcFT转基因植株35株,JcTFL1转基因植株4株,JcTFL2转基因植株22株,JcTFL3转基因植株4株。表型观察发现,与野生型拟南芥相比,超量表达JcFT基因的拟南芥显著提前开花;转35S∷JcTFL2和的拟南芥表现为晚花并且其莲座叶较多,株型较高,分支较多。而转35S∷JcMFT拟南芥也表现出晚花的表型,但其株型无显著差异。
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