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在橡胶生产上,非生物胁迫严重影响了橡胶的产量,特别是低温、干旱。近几年来,利用植物分子生物学技术来提高植物的抗寒、抗旱能力的研究进展十分迅速。特别是,一类能调节许多抗寒、耐旱和耐盐相关基因COR(ColdResponsive)的转录激活因子CBF(CRT/DRE-BindingFactor)的研究甚多,它位于冷应答调控网络的节点上,能激活下游众多与抗逆有关的功能基因的表达。目前对CBF途径的研究是众多冷应答途径中最为透彻的,功能最为明确的,也是植物抗寒分子育种目的基因的首选。本研究以巴西橡胶树(HeveaBrasiliensis)为试验材料,通过同源克隆的方法,从冷处理的橡胶树中分离到CBF冷应答途径上的几个相关基因;对它们进行了序列分析、功能预测、表达模式分析以及转化拟南芥的功能鉴定,内容概括如下:
1.利用间并引物进行PCR,从巴西橡胶树中克隆出两个AP2/EREBP类基因保守片断.序列分析显示,保守片断1来自本实验室已获得的HbCBF1;片断2则与拟南芥AP2/EREBP类转录因子有很高的同源性。
2.利用SAFA-PCR法成功获得HbCBF2的启动子序列。通过预测分析,存在一条50bp的启动子序列,存在Gapbox2和I-box。
3.通过对巴西橡胶树冷处理cDNA全长文库的序列筛选,获得与抗寒、抗旱相关的基因HbDREB2B和HbRD22。
4.NorthernBlotting杂交实验显示,HbCBF1、HbCBF2均能被低温诱导表达,相比而言,.HbCBF2被诱导的更为迅速;对于干旱胁迫,HbCBF1没有应答,说明其参与冷应答过程与干旱诱导途径互为独立;而HbCBF2则能迅速被脱水胁迫所诱导表达;HbDREB2B能被低温和干旱诱导,且表达丰度不受胁迫时间影响:HbRD22亦能被低温和干旱诱导,能迅速增加表达量,但随着胁迫时间的增长,表达量随之减少,甚至低于正常状态下的表达丰度。表明同类基因表达和功能具有多样性。
5.筛选鉴定出一些HbCBF1转化拟南芥的纯系植株。通过Northern杂交实验显示,HbCBF1在组成型强启动子CaMV35S驱动下,能在正常生长条件表达,并且能诱导拟南芥COR15a和RD29a基因的表达;在冷处理和干旱处理的情况下,HbCBF1的诱导效果则与拟南芥中内源COR15a的表达途径叠加:另一方面却抑制了RD29a的表达。
6.测定了三个转化株系的抗寒、抗旱相关生理指标,结果显示HbCBF1增强转化植株的抗寒性,却有可能限制了其抗旱能力.
综上所述,非低温驯化的巴西橡胶树中也存在CBF冷应答途径,说明热带植物在抗寒分子机制方面同源具有保守性,克隆得到的基因具有潜在的抗寒功能;同时,同源基因间表达谱的差异有揭示它们功能上的多样性和复杂性;转化植株的功能鉴定,表明HbCBF1在功能上与同源拟南芥CBF1具有相同性也存在差异性,需要更多的同源基因的筛选、鉴定,为橡胶树抗寒分子育种提供最佳的目标基因。