论文部分内容阅读
从内蒙古海拉尔地区的碱湖筛选到一株过氧化氢酶活力较高的低度嗜盐、兼性嗜碱细菌F26。经过对其16S rDNA序列的测定和比较发现,该菌株与两株嗜碱细菌Bacillus gibsonii(DSM 8722)和Bacillus horikoshii(DSM 8719)的同源性均为99 %。 菌株F26在pH 9.8及NaCl浓度5 %的条件下培养时,其胞内可检测到由5个过氧化氢酶组成的同工酶体系。而且,该同工酶体系中各成员的表达和细胞的培养时间、培养pH及培养NaCl浓度相关。 本论文将同工酶4作为目标碱性过氧化氢酶,通过硫酸铵沉淀-阴离子交换层析-凝胶过滤层析-疏水层析四步纯化过程对其进行了分离,最终得了到电泳纯的酶蛋白。该过氧化氢酶的天然分子量为140000 Da,扫描光谱图在408 nm处出现典型的吸收峰(Soret band)。吡啶血色素扫描光谱图证明了其以protoheme IX作为辅基。此外,计算可得该酶的表观米氏常数为32.5 mM,而且,该过氧化氢酶不受连二亚硫酸钠的还原作用影响,但被羟胺、氰化物、叠氮化物以及单功能过氧化氢酶的专一抑制剂——3-氨基-1,2,4-三唑强烈抑制。在以邻联茴香胺、邻苯二胺和二氨基联苯胺作为电子供体进行过氧化物酶的活性测定时发现,同工酶4不显示相应酶活。酶分子的N-端序列比对结果说明,所纯化的过氧化氢酶与双功能过氧化氢酶和锰过氧化氢酶亚群没有同源性,但与单功能过氧化氢酶亚群则有一定的相似性。综上所述,本论文将同工酶4定性为单功能过氧化氢酶。 另一方面,纯化的同工酶4在pH 11时有突显的酶活高峰,且其分子构型为同源二聚体,这是该酶区别于其它单功能过氧化氢酶的独特之处。到目前为止,能在pH 11时表现出高活性和高稳定性的过氧化氢酶还尚未有文献报道,而且,同工酶4也是第一个来源于嗜碱微生物的同源二聚体碱性过氧化氢酶。同时,该酶在pH 10.5和0.5M NaCl的条件下也表现出良好的耐受性,酶活半衰期达90个小时,这种突出的盐碱稳定性使其具备了在过氧化氢漂白废水处理中的应用潜力。此外,虽然同工酶4来源于中温微生物,但其所表现出来的冷适应性却和低温过氧化氢酶极为接近,因此,本论文将其描述为冷适应过氧化氢酶。 本论文同时从云南腾冲热海的热泉样品中筛选到一株嗜热碱产酶细菌A6。经过对其系统发育地位的分析发现,该菌株的16S rDNA序列与其它种没有很高的同源性。虽然菌株A6也生成芽孢,且与其相似性最高的一株菌为Bacillus horti,但同源性也仅为91 %。同时,将上述两株菌的生长条件进行比较后发现,其在生长温度范围上截然不同,因此,本论文认为菌株A6至少为一个新种,并且也有可能与Brevibacillus属和Aneurinibacillus属一样代表了芽孢杆菌类群当中的一个新属。