目的：衰老是生物界的普遍现象,肾脏是人体出现老化比较明显的脏器,其衰老对机体的影响尤为重要。我国65岁以上人口已经超过1亿,具有世界上最为庞大的老年人群,更为严峻的是慢性肾脏病(CKD)发病率逐年上升,特别是老年人群CKD发病率明显升高,老年肾脏疾病正逐渐成为影响国民健康和社会发展的主要疾病[1,2,3]。研究肾脏衰老机制、保护衰老肾脏功能是国家、社会及经济发展的重大需求,是关系到我国未来国民健康的重大课题。目前关于肾脏衰老的机制还不明确,肾小球系膜细胞(GMC)作为肾脏最重要的固有细胞,其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。研究GMC的表型和功能随衰老发生的改变及其发生机制有助于揭示肾脏衰老的机制。　　 细胞衰老的最重要的机制之一就是端粒长度的变化。端粒是真核细胞线性染色体末端的DNA重复序列,在染色体两端与核蛋白结合成复合物,它能阻止染色体末端被消化和降解,有着保护和稳定染色体的作用,但是端粒长度随着细胞的分裂而缩短,就会失去保护染色体的作用,染色体变得不稳定并发生重排、非整倍性变化等畸变,导致细胞复制性衰老而死亡,但是同一个细胞系的不同细胞的分裂增殖能力具有很大的差异,这种现象说明端粒缩短具有随机性,而氧化应激可能通过损伤端粒DNA而加速端粒缩短,从而加快细胞衰老。本课题组前期的研究已经发现:30.0mmolL-1葡萄糖、10-6molL-1血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用于人肾小球系膜细胞(HGMC)96h,可以造成细胞增殖能力下降,β-半乳糖苷酶染色阳性率增多等衰老表现,高糖和AngⅡ是否能加速HGMC端粒的缩短而促进衰老,值得进一步研究。　　 近年来,大量实验证明信号通路在调控衰老的起始和持续中起着重要的作用。JAK/STAT途径是一条重要的信号转导途径,广泛参与细胞的增殖、分化以及免疫调节等过程。本课题组前期的研究已经发现:高糖、AngⅡ刺激HGMC发生衰老时,细胞内STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达升高,说明JAK/STAT通路参与了HGMC的衰老,那么JAK/STAT通路参与HGMC衰老的具体机制,是否通过影响端粒长度而影响衰老,值得进一步深入研究。　　 方法：　　 一、端粒长度在衰老人肾小球系膜细胞中的变化：采用高糖和AngⅡ作为诱导HGMC衰老的刺激因素建立HGMC衰老模型,细胞同步化后分为:正常对照组(不含任何刺激因素)、高糖浓度组(葡萄糖:30.0mmolL-1)、AngⅡ组(AngⅡ:10-6molL-1),培养96h后收集细胞。在显微镜下观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞周期,并检测细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率,来判断衰老细胞模型是否成功建立,然后用Southern blot法检测各组细胞端粒长度的变化。　　 二、JAK/STAT通路对衰老人肾小球系膜细胞端粒长度的影响：采用高糖和AngⅡ作为诱导HGMC衰老的刺激因素建立HGMC衰老模型,细胞同步化后分为:正常对照组:高糖浓度组(葡萄糖:30.0mmolL-1);AngⅡ组(AngⅡ:10-6molL-1);高糖+Ag490组(Ag490:10.0umolL-1);AngⅡ+Ag490组(Ag490:10.0μmolL-1);各组细胞培养到96 h。Western blot法检测各组细胞STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白,P53、P21和PRB蛋白的表达变化,Southern blot法检测各组细胞端粒长度的变化。　　 三、普罗布考、氯沙坦对衰老人肾小球系膜细胞Jak/STAT通路和端粒长度的影响：将普罗布考、氯沙坦提前加入HGMC培养液中,分别在高糖和AngⅡ作用条件下培养,应用Southern bolt法检测端粒长度的变化,Westetn blot检测STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达、并检测细胞的衰老相关的β-半乳糖苷酶染色阳性率。　　 (一)高糖作用组:　　 实验分组:正常对照组；高糖浓度组(葡萄糖:30.0mmolL-1)；高糖+普罗布考组(普罗布考:40.0umolL-1)。　　 (二)AngⅡ作用组:　　 实验分组:正常对照组；AngⅡ组(AngⅡ:10-6molL-1)；AngⅡ+氯沙坦组(氯沙坦:10-5molL-1)。　　 结果：　　 一、端粒长度在衰老人肾小球系膜细胞中的变化光镜下观察:正常对照组细胞呈条梭形生长,排列规则,细胞边界清晰。与正常组细胞相比,高糖组和AngⅡ组细胞排列不规则,细胞体积变大,胞浆区域增大,胞浆中可见较多颗粒或空泡,边界模糊,形成致密单层细胞时间延长,数目减少。流式细胞仪分析显示:正常对照组细胞的各期比例正常,G0-G1期细胞比率为50.23±3.23％,而高糖组和AngⅡ组大部分细胞停滞于G0-G1期,S期及G2/M期则趋于消失,高糖组G0-G1期细胞比率为91.16±5.46％,AngⅡ组G0-G1期细胞比率为89.57±4.13％,比正常对照组明显增加,差异有显著性(P＜0.05)。高糖组和AngⅡ组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为65.62±6.56％和45.95±2.03％,比正常对照组24.11±4.71％明显增加,差异有显著性(P＜0.05)。正常对照组细胞平均端粒长度为8.14±1.12kb,高糖组和AngⅡ组细胞端粒长度比对照组明显缩短,分别为3.91±0.77kb和4.15±0.58kb,差异有显著性(P＜0.05)。　　 二、JAK/STAT通路对衰老人肾小球系膜细胞端粒长度的影响：HGMC内STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达在高糖和AngⅡ组比正常对照组均明显升高,而高糖+Ag490组比高糖组明显减低,AngⅡ+Ag490组比AngⅡ组明显减低(P＜0.05)。正常对照组细胞平均端粒长度为7.11±1.12 kb,高糖组和AngⅡ组细胞平均端粒长度比对照组明显的缩短,分别为3.90±0.72kb和4.15±0.81kb。高糖+Ag490组细胞平均端粒长度为5.05±0.92kb,比高糖组明显延长,AngⅡ+Ag490组细胞平均端粒长度为5.13±1.28kb,比AngⅡ组明显延长(P＜0.05)。HGMC内P53、P21和PRB蛋白在正常对照组仅有少量表达,在高糖和AngⅡ组均明显升高,而高糖+Ag490组比高糖组明显减低,AngⅡ+Ag490组比AngⅡ组明显减低(P＜0.05)。　　 三、普罗布考、氯沙坦对衰老人肾小球系膜细胞JAK/STAT通路和端粒长度的影响：正常对照组细胞平均端粒长度为4.82±1.21kb,高糖组细胞平均端粒长度为3.26±0.34kb,比对照组明显的缩短,普罗布考组细胞平均端粒长度为3.91±0.18 kb,比高糖组明显延长,但仍小于正常对照组。高糖组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率为60.66±4.76％,比正常对照组16.71±4.21％明显增加,普罗布考组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率为29.6±3.23％,较高糖组明显降低。普罗布考组细胞内STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达均比高糖组有所下降。　　 AngⅡ组细胞平均端粒长度为3.35±1.03kb,比对照组5.62±1.47kb明显缩短,氯沙坦组平均细胞端粒长度为4.31±0.22kb,比AngⅡ组延长,但仍小于正常对照组。AngⅡ组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率为60.66±4.76％,比正常对照组16.71±4.21％明显增加,氯沙坦组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率为27.3±3.18％,比AngⅡ组增加。氯沙坦组细胞STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达均比AngⅡ组有所下降。　　 结论：　　 1、高糖、AngⅡ在体外能促进HGMC的端粒长度缩短。　　 2、高糖、AngⅡ能诱导衰老的HGMC中的STAT1、STAT3磷酸化增加。在高糖、AngⅡ诱导衰老的HGMC中,阻断JAK/STAT通路后端粒长度缩短明显减轻,P53、P21和PRB蛋白表达下降,细胞衰老减轻。　　 3、普罗布考、氯沙坦分别能减轻高糖和AngⅡ加速的HGMC端粒缩短,降低STAT1、STAT、P-STAT1、P-STAT3蛋白的表达,从而减轻HGMC衰老。