病毒特异性的细胞受体是病毒入侵细胞的门户,决定病毒的宿主范围、组织及细胞嗜性。从受体角度阐明病毒入侵机制,是病毒性疾病的药物研发及疫苗研制的重要方面。选择性剪接可使同一基因编码出功能不同蛋白,选择性剪接对满足生物体复杂性所需蛋白多样性具有重要意义。鉴定不同选择性剪接变异体的功能已成为生物学界研究的热点。马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)受体(ELR1)是2005年Zhang等通过克隆表达技术发现的,其属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)蛋白家族,本研究在原代培养的马的单核巨噬细胞上克隆ELR1的过程中,发现其mRNA基因序列存在选择性剪接形式,即其cDNA序列除所报导的序列ELR1外,还存在插入序列ELR1-IN和缺失序列ELR1-DE,ELR1-IN在已公布的序列的786-787位之间插入153bp,ELR1-DE型序列缺失了所公布序列415-478位64bp。不论序列的插入还是缺失均导致编码框的移位,而产生截短的受体多肽片段。为定量各种形式受体在体内的表达比率,本研究建立了可以特异性检测各种形式受体表达比率的SYBR Green real-time RT-PCR方法。该方法通过在不同的位置设计引物来分别定量三种形式剪接体(ELR1+ELR1-IN+ELR1-DE)、两种形式剪接体(ELR1+ELR1-IN)及插入型剪接体(ELR1-IN)的拷贝数,通过运算就可以定量出每种剪接体的拷贝数并确定它们之间的表达比率。同时为减少实验误差,本研究仅采用插入型序列质粒来构建标准品,每对引物均应用这个标准品来定量各自所扩增基因的拷贝数,这样就减少了标准品之间差异所造成的误差。并通过比较了三对不同引物扩增同一标准品的符合程度确定这种方法可行。应用这种方法定量出每种形式受体的表达比率为ELR1-IN:ELR1-DE:ELR1=3:1.7:1。为确定各种形式选择性剪接变异体的蛋白表达形式,本研究将每种剪接变异体序列均连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建成真核表达质粒,转染入293细胞和Hela细胞,通过间接免疫荧光和Western-blot证明各种形式受体均可表达,膜结合型受体ELR1表达蛋白49ku,且均表达在细胞膜上,插入型受体ELR1-IN表达蛋白大小在38ku左右,以可溶性形式表达,缺失型序列ELR1-DE可以以第二个编码区编码蛋白,表达蛋白大小在36ku左右,表达在细胞膜上。为研究可溶性受体的功能,本研究分别构建了稳定表达膜结合型受体和稳定表达插入型受体的293细胞系,分别命名为293-ELR1和293-ELR1-IN,通过real-time RT-PCR和RT酶活性检测,结果表明293-ELR1细胞系可以支持EIAV的驴胎皮肤细胞弱毒FDDV毒株的进入及复制,而对于293-ELR1-IN细胞系,推测仅可以支持病毒的进入,并不能支持病毒的复制。将插入型序列的真核表达质粒转染293-ELR1细胞并以真核表达载体pcDNA3.1(+)及未转染的空白293-ELR1细胞为阴性对照,转染后接种FDDV毒株并应用RT酶活性检测病毒活性,结果表明转染插入型序列质粒的受体组病毒活性明显低于转染真核表达载体pcDNA3.1(+)及未转染的空白293-ELR1细胞中病毒的活性,说明插入型序列表达的可溶性受体可以明显抑制FDDV毒株的感染表达膜结合型病毒受体的细胞系。为进一步研究病毒与受体相互作用的机制,针对病毒受体的特异性抗体是后期实验所必需的,故本实验又构建了ELR1基因的完整编码区及胞内区的原核表达体系,并实现了其在大肠杆菌中的表达,为下一步制备ELR1蛋白多克隆抗体及从受体角度阐明EIAV减毒活疫苗的免疫保护机制奠定了基础。