目的：　　本文拟构建pMH3-B7-H2-Fc重组表达质粒，通过电穿孔转染方法转染入CHO-K1细胞中表达，琼脂糖亲和介质(Protein A)纯化，制备出B7-H2-Fc融合蛋白，并在体外研究其生物学功能，为下一步体外扩增调节性T细胞及其对自身免疫性疾病治疗的临床前研究奠定基础。　　方法：　　1.构建pcDNA3.1-B7-H2-Fc重组表达质粒　　从人外周血单个核细胞中提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别扩增目的基因B7-H2和IgG1 Fc，重叠PCR将这两段不连续的基因片段相连并扩增，得到融合基因B7-H2-Fc，胶回收以纯化目的片段，HindⅢ和XhoⅠ分别双酶切目的基因与载体pcDNA3.1Hygro(+)，连接并转化入DH5α感受态细胞，经菌液PCR鉴定和质粒酶切鉴定后送DNA测序。　　2.构建pMH3-B7-H2-Fc重组表达质粒　　提取已构建好的pcDNA3.1-B7-H2-Fc重组表达质粒，以其为模板，PCR获得目的基因B7-H2-Fc，胶回收后，将目的基因和载体pMH3用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，然后连接并转化入DH5α感受态细胞，经菌液PCR鉴定送DNA测序。　　3.B7-H2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达　　将构建好的富含GC的重组表达质粒pMH3-B7-H2-Fc转染哺乳动物细胞CHO-K1，通过G418筛选及两轮单克隆细胞株的挑选，Dot blot检测，得到稳定高表达细胞株。Western blot鉴定目的蛋白，选取表达量最高的细胞株作为种子细胞。　　4.B7-H2-Fc融合蛋白的纯化　　收集无血清DMEM/F12培养基培养的工程细胞株上清，琼脂糖亲和介质(Protein A)纯化得到B7-H2-Fc目的蛋白，并用SDS-PAGE和Western Blot进行检测，BCA法检测融合蛋白浓度。　　5.T细胞增殖试验　　96孔板中预先包被40ng/ml抗人CD3单克隆抗体，及不同浓度的B7-H2-Fc融合蛋白，将从人外周血中分离纯化的PBMCs或T细胞，以一定密度接种96孔板，37℃、5％CO2培养箱中培养数天后，流式细胞术或CCK8检测T细胞增殖情况，初步评价B7-H2-Fc融合蛋白的体外生物学活性。　　结果：　　1.成功构建pcDNA3.1-B7-H2-Fc重组表达质粒　　菌液PCR及质粒双酶切（HindⅢ和XhoⅠ）鉴定合格后，对重组表达质粒进行DNA测序，结果与GenBank收录的人B7-H2、IgG1 Fc序列一致，基因读码框正确。　　2.成功构建pMH3-B7-H2-Fc重组表达质粒　　3.B7-H2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达　　质粒pMH3-B7-H2-Fc稳定转染CHO-K1细胞，经G418筛选及两轮单克隆挑选，得到工程细胞株。Dot blot检测，选取表达量前三的细胞株作为种子细胞。Western blot显示，在约170kDa大小位置出现特异的目的蛋白条带。　　4.B7-H2-Fc融合蛋白的纯化　　收集无血清DMEM/F12培养基培养的工程细胞株上清，Protein A纯化得到B7-H2-Fc目的蛋白;PBS透析后，SDS-PAGE显示，有且仅有一条B7-H2-Fc融合蛋白带，且非还原状态下以二聚体形式存在。　　5.体外T细胞增殖试验　　流式细胞术或CCK-8检测体外T细胞增殖，结果显示，B7-H2-Fc融合蛋白有促进人外周血T淋巴细胞体外增殖的活性，且随着B7-H2-Fc融合蛋白浓度的升高，T细胞增殖越明显，即呈剂量依赖性。　　结论：　　本文成功构建了pMH3-B7-H2-Fc重组表达质粒，并稳定转染入CHO-K1细胞表达，获得了稳定高表达B7-H2-Fc融合蛋白的工程细胞株。通过ProteinA亲和层析制备了B7-H2-Fc融合蛋白，并通过体外人T淋巴细胞增殖试验初步证实了B7-H2-Fc融合蛋白在体外具有促进T细胞增殖的生物活性，且此活性与B7-H2-Fc融合蛋白呈剂量依赖性，为后续体外扩增调节性T淋巴细胞并用于人体回输以治疗自身免疫性疾病的临床前研究奠定了基础。