luxCDABE发光细菌的构建及在抗生素药效评价和脑膜炎感染机制研究中的应用

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快速、实时、可视化的动物模型和技术为细菌感染机制研究和药物研发评价提供了核心的技术手段。lux CDABE生物发光系统具有无需添加荧光素酶底物、可自动产生生物发光信号的特点,是一种在活体动物模型上分析细菌感染机制、病原定殖和迁移变化规律的有效工具,同时为抗生素药效评价、快速筛选提供了高通量的解决办法和研究思路。本研究目标是通过构建多株稳定表达lux CDABE生物发光系统的细菌,建立生物发光细菌和药物相互作用的体外监测模型和活体成像监测模型;在此基础上,建立急性细菌性脑膜脑炎感染与药物评价模型,通过乙酰化蛋白修饰组学探讨急性细菌性脑膜脑炎感染机理。1.lux CDABE生物发光细菌的构建与生物学评价lux CDABE操作子有别于其他生物发光报告系统,其无需添加荧光素酶底物,载体质粒p BBR1MCS-2是一种可在多种革兰氏阴性菌稳定存在的广宿主质粒。本研究首先构建生物发光质粒p BBR1MCS-lux,将该质粒电转化到多株革兰氏阴性菌中,成功构建生物发光阪崎肠杆菌、生物发光大肠杆菌0157:H7、生物发光鼠伤寒沙门氏菌和生物发光福氏志贺氏菌,其发光强度和细菌数量CFU呈线性相关,导入的质粒遗传稳定,不影响细菌的生长。实验结果表明,生物发光质粒p BBR1MCS-lux是一个广宿主生物发光质粒,通过该质粒构建的生物发光细菌发光信号强,可实时反映细菌的生长变化。基于生物发光质粒p BBR1MCS-lux的生物发光构建策略适用于多种革兰氏阴性菌发光菌株的构建,应用前景可观。2.lux CDABE系统在细菌抗生素药效评价中的应用研究为实现快速评价抗生素敏感性的目的,通过监测生物发光细菌和不同药物相互作用时发光信号的改变,建立生物发光细菌光信号MIC测定法;通过连续监测生物发光大肠杆菌0157:H7感染和治疗组成像结果,建立抗生素快速评价活体成像模型。实验结果表明,在有效抑菌浓度条件下(高于MIC)四株细菌均在2h之后发光强度和细菌数量被抑制,证明通过监测发光信号可在2h快速判断药物MIC;在有效治疗剂量情况下,细菌数量和发光强度被抑制,通过监测发光信号可实时评价抗生素治疗效果。在低于MIC情况下,四株发光细菌的发光强度和细菌数量没有被抑制,反而随时间逐步增高。这也是首次在体内感染模型中报道,在低于有效治疗剂量,即细菌数量和发光强度随时间逐渐增强效应。这种低于MIC和低于有效治疗剂量出现发光强度和细菌数量增加的效应,在利用生物发光信号体内外评价药物的模型中,应该引起足够的重视和关注。3.lux CDABE系统在细菌性脑膜炎感染与治疗模型中的应用研究阪崎肠杆菌属是一种重要的新发食源性致病菌,其临床症状主要急性细菌性脑膜炎和坏死性小肠结肠炎。对其感染机制研究尚属空白,对阪崎肠杆菌深入研究为急性细菌性脑膜脑炎病理机制提供重要参考。穆汀斯克罗诺菌是阪崎肠杆菌属一个亚种,其毒力相对较强,通过构建生物发光穆汀斯克罗诺菌,建立急性细菌性脑膜炎感染和治疗成像模型,首次实现了经腹腔注射感染途径脑部活体检测信号的目的,还原其自然感染过程中菌血症引发细菌性脑膜炎的感染过程,鉴定发现其在脑组织出现细菌为感染后6h,以此作为重要分组依据。通过乙酰化蛋白修饰组学和炎性细胞因子的分析其感染机制。发现Spna2、Acly的乙酰化修饰参与多种功能实现。发现在穆汀斯克罗诺菌造成的急性脑膜炎病理过程中,从0-6h,参与血管调节蛋白乙酰化修饰上调,参与细胞的趋化作用细胞因子大量分泌,募集炎性细胞向脑组织感染部位的迁移;同时穆汀斯克罗诺菌感染导致参与细胞凋亡和程序性死亡的调节蛋白乙酰化修饰下降,进而导致了机体细胞死亡调节的失衡。6h之后,随感染进程加剧,参与内吞作用的蛋白乙酰化水平上调,参与脑组织细胞对定殖细菌的清除;但由于感染加剧,参与脑组织中细胞有丝分裂的蛋白乙酰化水平下调,细菌在脑组织进一步大量定殖,引发炎症因子风暴,进一步造成了脑组织细胞大量死亡。
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