【摘 要】
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目的:探讨肝纤维化及肝星状细胞活化过程中整合素α5β1信号转导变化特点,及扶正化瘀方干预该信号转导以及肝星状细胞与细胞外基质间联系的抗肝纤维化作用机制.方法:1.二甲基
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目的:探讨肝纤维化及肝星状细胞活化过程中整合素α5β1信号转导变化特点,及扶正化瘀方干预该信号转导以及肝星状细胞与细胞外基质间联系的抗肝纤维化作用机制.方法:1.二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射复制大鼠肝纤维化模型,分为3组:正常组、模型组和扶正化瘀方治疗组.模型组又分为染素养1d、3d、1w、2w、3w、4w及模型5w、6w、8w共9个观察点;治疗组在成模后第5w给扶正化瘀方,共4w.2.分离培养正常大鼠HSC,以10﹪小牛血清/M199原代培养,分为正常组和FN包被组,并为1d、4d、7d3个观察点.选择培养1d HSC进行药效实验,分为4组:正常组、对照组、扶正化瘀方药物血清组和维甲酸组.后3组均以FN包被,正常组和对照组加105NRS,药物组加10﹪药物血清,维甲酸组加10﹪NRS和10-6M的维甲酸.3.盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量.4.免疫组化染色观察肝组织α-SMA和FN表达.5.倒置显微镜观察HSC伸展与形态,MTT和alamar Blue法测定HSC增殖.6.Western印迹法分析肝组织及肝星状细胞α-SMA、FN、α5β1、FAK/p-FAK、ERK/p-ERK蛋白表达.7.明胶酶图法测定HSC MMP-2、MMP-9活性.结论:1.肝纤维化过程中整合素α5β1的信号转导变化特点表现为:α5β1蛋白表达增加,胞内信号分子-FAK和ERK磷酸化增强,肝损伤早期表达增加的FN可通过整合素α5β1及其胞内信号转导途径以促进HSC活化与肝纤维化.2.FN对血清培养的原代HSC具有歧化效应特点,对静止HSC,明显促进细胞伸展与增殖,对MMP-2活性无明显影响;对活化HSC,促伸展与增殖作用消失,而明显促进MMP-2活化.该歧化效应与整合素信号通路中受体及胞内信号分子活性变化有关,即在于FN明显促进静止HSC的整合素α5β1蛋白表达、FAK与ERK的磷酸化.3.扶正化瘀方可通过干预胞外基质FN与HSC的相互联系、影响FN促HSC增殖活化而抗肝纤维化,其相关作用特点表现为:抑制纤维化肝脏FN表达与沉积;抑制纤维化肝脏与HSC中整合素α5β1表达及其ERK、FAK磷酸化;促进HSC中MMP-2活性.该实验首次发现药物血清方法可较好用于复方中药干预胞外基质的细胞信号转导作用机制研究.
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