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纳米银优良的杀菌消炎特性及物理化学性能使其在工业生产、生物医药及日常生活中得到了大量的应用,是目前商业化程度最高、应用最为广泛的纳米材料之一。但是,在为人们带来便利的同时,纳米银的负面效应也逐渐引起了公众的关注。纳米银本身性质活泼,在水环境中是高度动态的,一旦释放到环境里,在迁移过程中可能会发生不同的物理化学转变,而不同形态银的毒性、生物有效性相差很大。因此,发展不同形态的银的分离测定方法,研究纳米银在环境及生物体内的物理化学转化,有助于更加合理地评估纳米银的潜在环境风险。 本文针对水环境及生物基质中纳米银与银离子的分离和转化开展了相关的研究工作,将超滤技术和基于Triton X-114浊点萃取技术与电感耦合等离子体质谱及其他多种表征技术相结合,发展了环境水体和细胞中纳米银与银离子的分离测定技术,并研究了它们在环境相关条件下及生物体内的相互转化。论文主要包括以下几个部分: 首先,我们从多种合成纳米银的方法中选择了两种快速简单的水相合成方法,并对合成及纯化的条件进行了优化,从而得到了两种粒径分布均一、能长时间稳定的纳米银,为后续的实验奠定了基础。 然后,我们选择PVP包裹的纳米银(25 nm),考察了自然光照、天然有机质、Ca2+/Mg2+、Cl-和S2-等重要的环境因素对环境水体中纳米银的形貌及化学转变的影响。研究表明,光照能够引发纳米银形貌变化,使原来分散良好的纳米银逐渐融合,自组装形成2D的纳米结构,并进一步生长成大的团聚体。银离子的释放也非常明显,光照48 h,大约有80%的纳米银转化为银离子。但加入天然有机质后,光照条件下纳米银也能长时间分散,表明在有机质含量高的水体中纳米银能够长时间稳定存在,可能会发生长距离的迁移,对水体生物造成持久的危害;同时银离子的释放大大下降,大约只有20%的纳米银被氧化,且呈现先升高又快速下降的趋势。TEM检测观察到有大量小的纳米银颗粒的生成,表明纳米银在环境中高度动态,存在着氧化释放出银离子和银离子再还原生成纳米银的循环。进一步的实验发现,在自然水体pH范围内(pH5-8)及Ca2+/Mg2+、CI和S2-存在下,该现象是普遍发生的。虽然纳米银毒性的机理并不非常明确,但普遍认为与银离子的释放密切相关。我们的研究发现在有机质丰富的水体中,经日光照射一段时间后银离子释放逐渐下降,表明纳米银的毒性可能会发生一定程度的下降。以往的研究结果也发现,纳米银的富集、生物有效性及毒性都与纳米颗粒的尺寸有关,我们实验中发现的在光照条件下有小颗粒的生成及大的团聚体的出现,表明传统的毒性实验只关注纳米银原始的颗粒并不科学,需要进一步关注在实际环境条件下纳米颗粒的变化及毒性。 在上述研究工作的基础上,我们分别制备了富同位素107Ag的纳米银和富同位素109Ag的银离子,用同位素示踪的方法,初步研究了在环境相关条件下,纳米银与银离子之间的相互转化。结果发现,在简单的纳米银水溶液中,没有还原性物质加入时,体系中以纳米银的氧化为主。避光条件下,纳米银的氧化符合近一级反应动力学过程,反应速率为0.01976 h-1;光照条件下,氧化过程较复杂,不能用简单近一级反应来描述。当有腐殖酸存在时,纳米银水溶液中银离子进一步还原生成纳米银不容忽略,且光照条件下该还原反应更加明显,反应速率为0.00632 h-1,约是避光条件下的3倍。但腐殖酸存在时纳米银的氧化更为复杂,需要进一步深入的研究。 论文的最后一部分主要针对细胞中纳米银的分离测定和纳米银的细胞摄入而展开。纳米银的毒性究竟是来源于纳米颗粒本身还是银离子,还存在很大的争议,这是因为二者往往共存,且目前没有好的方法能够将二者从生物基质中分离。因此,我们发展了基于表面活性剂TX-114的浊点萃取的方法,分离HepG2细胞中的纳米银和银离子。向破碎的细胞液中加入Na2S2O3后,一方面它能够和银离子络合生成水溶性的复合物防止银离子被萃取到TX-114相,另一方面盐效应能够促进相分离。将萃取溶液加热至浊点温度以上,出现浑浊以后,通过低速离心,纳米银被萃取至下层富表面活性剂相,而银离子保留在上层水相,从而实现它们的分离。然后分别收集上下层,经微波消解后用ICP-MS定量。在最优的条件下,细胞裂解液中超过67%的纳米银被萃取至TX-114相,而94%的银离子保留在上层水相。该方法可以定量测定纳米银暴露的HepG2细胞中银离子和纳米银的含量。基于建立的分析方法,研究了纳米银在HepG2细胞中摄入。细胞经过10 mg/L纳米银暴露24 h后,约有67.8 ng/104的银进入细胞,其中约10.3%为银离子。与最初纳米银溶液中银离子含量(约5.2%)相比,明显升高的银离子的含量表明可能有部分纳米银在细胞体内转变为银离子,也可能由于细胞对银离子的吞噬速率明显高于纳米银。由于已报道的数据中,银离子的毒性明显高于纳米银,而暴露的细胞中大量银离子的存在表明在考察纳米银对生物体的毒性效应时,银离子的生物毒性不可忽略。同时先前的研究将生物体内银的总量作为纳米银的吞噬量也需要重新考虑。