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背景microRNAs (miRNAs)是于2003年发现的一类长度约22碱基的短链寡核苷酸,其主要功能是通过序列特异性方式调节靶基因的表达。近年来资料表明,某些miRNAs参与调控血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)组织特异型基因表达,在VECs正常分化、增殖、凋亡和血管新生等生理过程中表达水平发生明显改变,可能具有重要的调节作用。血管新生(angiogenesis)主要有两个重要反应,分别是新生血管形成(nascentangiogenesis)和血管生成(Vasculogenesis),且均与 VECs 密切相关。血管新生作为正常生理过程参与多个器官稳态的维持;近年来研究证实,其异常则与心血管疾病密切相关。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)是血管内皮组织特异型蛋白,其介导生成的一氧化氮(nitric oxide,NO)是维持血管内稳态的重要调节因子。我们的前期研究发现,eNOS基因受内含子源性27nt-miRNA和miRNA-21的调节,并且与核肌动蛋白和多种转录因子(例如Sp1)共同参与对VECs增殖和凋亡的调控。近来研究提示,miR-24对血管内皮组织特异性基因表达的调控及其分子机制的研究甚少,对血管新生过程的影响尚未见报道。我们新近发现,miR-24在心肌梗塞和高血压病人血浆中有差异性表达,而这种改变可能涉及miR-24对VECs病理和生理过程的调控。我们前期研究提示miR-24对内皮细胞增殖的调控与其抑制eNOS和Sp1的表达有关。然而这一调节过程是否参与血管形成的调控和心血管疾病的发生发展,目前尚不清楚。目的研究miR-24对eNOS基因表达调节的分子机制及其对内皮细胞增殖的影响;研究miR-24对内皮细胞eNOS基因表达的分子调节机制及其对体外管腔形成的影响;进一步研究miR-24对内皮细胞分化的分子调节机制及其对血管新生的影响;深入探讨miR-24对心血管系统发育和心血管疾病发生发展的作用。方法1检测miR-24对人脐静脉内皮细胞eNOS和Sp1表达的影响构建miR-24及其反义序列的高表达质粒,使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂根据转染质粒将人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)分为:miR-24 高表达组、miR-24 干扰(anti-miR-24)组和空白质粒对照组。采用RT-PCR分别检测eNOS和Sp1转录因子的mRNA表达水平;采用Western blotting分别检测eNOS和Spl转录因子的蛋白表达情况。2检测miR-24对HUVECs增殖、迁移和管腔形成的影响构建miR-24及其反义序列的高表达质粒,使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂根据转染质粒将HUVECs分为:miR-24高表达组、miR-24干扰(anti-miR-24)组和空白质粒对照组。于细胞转染后的24、48和72 h三个时间点,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分别检测各组HUVECs增殖能力;采用Transwell试验分别检测各组细胞的迁移能力;采用人工基底膜(Matrigel)分别检测各组细胞的成管能力。3检测miR-24对间充质干细胞定向内皮细胞分化的影响构建miR-24及其反义序列的高表达质粒,使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂根据转染质粒将人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,HBMSCs)分为:miR-24 高表达组、miR-24 干扰(anti-miR-24)组和空白质粒对照组;采用VEGF和b-FGF联合诱导方案,使HBMSCs定向内皮细胞分化;镜下观察分化期间各组细胞形态学变化并拍照;采用硝酸还原酶法检测分化期间第1、3、5、7、9天,5个时间点各组细胞液上清的NO浓度;采用免疫细胞化学分别检测各组HBMSCs诱导分化后eNOS和Sp1蛋白的表达情况;采用人工基底膜(Matrigel)分别检测各组HBMSCs诱导分化后的成管能力。4检测miR-24对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响收集HBMSCs条件培养基;采用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)模型分别检测miR-24对血管形成的影响。结果1与对照组比较,HUVECs miR-24高表达组eNOS和Sp1的mRNA(P<0.05)和蛋白表达明显减少(P<0.05)。2与对照组比较,miR-24高表达组细胞增殖明显降低(P<0.05),迁移数目降低(P<0.05),且未能形成明显管腔样结构。3与对照组比较,miR-24高表达组HBMSCs未见内皮样形态,分化期间培养液上清NO浓度明显降低(P<0.05),诱导分化后HBMSCs eNOS和Sp1的荧光强度明显降低,且未能形成明显管腔样结构。4与对照组比较,miR-24高表达组CAM血管新生数目明显降低(P<0.05),血管新生面积比率降低(P<0.05)。结论1 miR-24显著抑制HUVECs eNOS mRNA和蛋白质的表达,核转录因子Sp1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。2miR-24显著抑制HUVECs的增殖、迁移和体外管腔形成能力,并且与其调控eNOS的表达有关。3 miR-24显著抑制HBMSCs定向内皮细胞分化及诱导分化后的体外管腔形成能力,并且与其调控eNOS的表达有关。4 miR-24显著抑制CAM血管形成与其抑制HBMSCs的分化有关。