第一部分 复合唑来膦酸骨水泥凝固时间及生物力学研究目的：聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥作为重要的临床常用填充材料之一,在骨科已有60多年的应用历史。随着人口老龄化的到来,各种终末期关节疾病越来越多见。关节假体置换术是一种治疗此类疾病非常有效的方式,骨水泥作为一种填充固定材料广泛应用于此类手术中。同时各种转移性骨肿瘤和骨质疏松所引起的椎体疾病也呈现出上升趋势,给社会带来了沉重的负担。而骨水泥的经皮椎体成形术是临床治疗此类疾病引起的椎体压缩性骨折的经典术式。因此,PMMA骨水泥在临床中有着难以替代的地位。而它除了发挥本身的填充支持效果外,没有其它附加治疗效果。二膦酸盐是一类经人工合成得到的焦磷酸盐类似物,在临床上广泛应用于治疗骨质疏松症、转移性骨病、恶性肿瘤引起的高钙血症、畸形性骨炎等代谢性骨病。并可以抑制磨损微粒引起的骨溶解,对防止无菌性松动有效。本部分的目的是探究唑来膦酸复合入骨水泥后对骨水泥终凝时间及机械性能的影响及可能的影响机制,为复合唑来膦酸骨水泥的临床应用奠定生物机械力学基础。方法：将唑来膦酸与骨水泥以不同质量比混合,分为A(空白对照)、B(4mg)、C (20mg)、D (40mg)、E (80mg)五组。标本制备开始前,将实验材料及所用混合装备在23±1℃的环境中预热至少2小时。然后根据IS05833：2002《外科植入物--丙烯酸类树脂骨水泥》标准,在无菌、温度23±1℃、相对湿度不低于40%的环境下(手术室环境),无菌操作制作直径为6±0.1mm、高12±0.1mm的骨水泥圆柱体。标准维卡仪测量其终凝时间,终凝针针头直径为1mm,针头质量为400g。从混合开始计时,每隔一段时间取一标本置放于测试台上,小心将终凝针头垂直下降于样本表面,已其自身重力轻触待测样品表面,停留5秒。至样本表面无明显压痕出现为止,记录出终凝时间。再在相同条件下,参照标准制作抗压及抗弯标本。经处理、测量、X线投射后选入合格标本,于电子万能材料试验机上测定其抗压强度、抗弯强度及抗弯模量。结果：终凝时间结果显示唑来膦酸的加入对骨水泥的凝固时间无明显影响。与空白对照组(A组)相比,4mg(B组)、20mg(C组)、40mg(D组)、80mg(E组)唑来膦酸加入组的时间改变无统计学差异(P>0.05)。机械力学测试结果显示,复合骨水泥的抗压强度、抗弯强度及抗弯模量都随唑来膦酸加入量的增多而下降。与空白对照组(A组)相比,40mg(D组)、80mg(E组)唑来膦酸加入组的三项机械性能指标下降有统计学差异(P<0.05)。浸提4周后,E组抗压强度呈下降,其余各组抗压强度呈上升。对于抗弯强度和抗弯模量,浸提4周后除E组抗弯强度下降(P<0.05),其余各组均无明显变化。结论：唑来膦酸的加入对骨水泥的抗压强度、抗弯强度及抗弯模量均有影响,随着唑来膦酸加入量的增加,终凝时间无明显差异。抗压强度、抗弯强度和抗弯模量呈降低。但各项指标均达到IS05833：2002《外科植入物--丙烯酸类树脂骨水泥》标准。在44g聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中加入不大于80mg唑来膦酸基本生物力学指标符合使用要求。第二部分 复合唑来膦酸骨水泥的释放特性研究目的：唑来膦酸为第三代二膦酸盐的代表药物,也是目前临床上效果最强的二膦酸盐。给药途径一般为静脉注射,输入人体后大部分快速经肾脏代谢,存在生物利用度低、肾毒性等缺点。剩余的小部分储存于全身骨组织中,形成缓慢释放,不能使病灶部位保持较高浓度。而载体的局部释放作为能有效解决上述缺点的方法,被人们所关注和研究。复合唑来膦酸骨水泥是将骨水泥作为唑来膦酸缓释载体的一种局部给药系统,使唑来膦酸在病灶部位缓慢释放,形成一个长时间、高浓度的药物作用环境。从而提高唑来膦酸抑制破骨细胞,促进成骨细胞和凋亡肿瘤细胞的效果。而复合骨水泥的药物释放情况和特性如何,也决定了其是否具有临床使用的潜力,并间接反映出复合物对骨水泥微观结构的影响。该部分通过高效液相色谱对复合骨水泥的释放情况进行了研究,总结出复合骨水泥的溶出特性,为复合唑来膦酸骨水泥应用于临床提供了药物动力学基础。方法：将唑来膦酸与骨水泥以不同质量比混合,分为A(空白对照)、B (4mg)、C (20mg)、D (40mg)、E (80mg)五组。浸提实验所用标本的样式与第一部分抗压强度实验标本相同。将实验材料及所用混合装备在23±1℃的环境中预热至少2小时,然后开始标本的制备。根据IS05833：2002《外科植入物--丙烯酸类树脂骨水泥》标准,在无菌环境下制作浸提实验所用各组标本。用游标卡尺精确量取尺寸,排除尺寸不符合的标本。尺寸符合要求的标本再经过X线透射检查,将其中密度不均匀、有明显空隙、有明显低密度者予以排除。选入X线下密度均匀,边缘整齐的标本。每组取4个标本,分别称取每个标本重量。将标本浸泡于完全相同的5m1无菌去离子水中,置于37℃恒温箱,每24小时取一次浸提液。取完样品后,复合骨水泥标本用无菌去离子水冲洗3遍。标本冲洗完后重新放入5ml新无菌去离子水中洗提,持续浸提取样4周。取样结束后,将1、2、3、4、5、6、7、9、11、14、28d各组样品送武汉大学测试中心用高效液相色谱仪检测药物浓度。结果：在选用的色谱条件下,可在进样11分钟时检测到唑来膦酸信号。各组的最大释放浓度均在第一天出现,且同一时间点的释放浓度,随着唑来膦酸加入量的增多而增大。在前3天,各组每日释放量下降迅速。在第5天,B组洗提液中唑来膦酸的浓度已经超出了所选方法的检测范围。在第11天,C-E组浸提液中未检出唑来膦酸的浓度。其释放曲线与指数曲线模型拟合良好,B-E组R值依次为0.994、0.950、0.973、0.990。B组释放百分比在每个时间点均为最大,第四天已达到40.36%。C、D、E三组在第七天的释放总量百分比依次为28.34%、15.90%、12.91%。结论：唑来麟酸可以从骨水泥中释放出来。随着唑来膦酸加入量的增加,各组的总释放量呈增加的趋势,而每个时间点的释放总量百分比呈降低的趋势。复合骨水泥的释放呈指数特征,在前三天释放显著。第三部分 复合唑来膦酸骨水泥浸提液的细胞生物学研究目的：骨水泥的液相与固相混合时,液相中的甲基丙烯酸甲酯单体迅速发生聚合反应,其释放温度在70-120℃之间。这种高温是否会对唑来膦酸的药物性能产生影响,是需要关注的问题之一,也决定了复合骨水泥可否在实际中得到真正应用。人工关节无菌性松动的根本原因是假体周围成骨作用和骨溶解作用动态失衡的结果。唑来膦酸浓度在10-9mol/L时即可对破骨细胞的活性和增殖产生明显抑制。但有关唑来膦酸对成骨细胞作用的研究还很少,对作用效果和作用途径还存在争议。近几年来恶性肿瘤的发生率不断升高,骨转移是其常见的转移途径之一。在发生转移的原发肿瘤中,乳腺癌较为常见。唑来膦酸可以通过对乳腺癌细胞中焦磷酸法尼酯合酶(FPPS)的抑制作用,最终激活乳腺癌细胞的caspase凋亡通路起到抑瘤作用。本部分将浸提液作用于乳腺癌细胞和成骨细胞,通过MTT实验探讨聚合时形成的高温是否会对唑来膦酸的药物活性产生影响,为复合唑来膦酸骨水泥应用于临床提供依据。方法：用15ml L-15培养基于37℃恒温环境中,对复合0mg、4mg、20mg、40mg、 80mg唑来膦酸的骨水泥浸提24小时。然后将含药培养基作用于96孔板上的乳腺癌细胞。从新生SD大鼠的顶骨中获取原代大鼠成骨细胞,并进行增殖和纯化。取E(80mg)组第1、9、14、21天的浸提液为实验组,将其添加入培养基中配制成含唑来膦酸的DMEM培养基。用标准品配制含唑来膦酸浓度为10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L、10-11mol/L的DMEM培养基。将各组于96孔板上分别作用于大鼠成骨细胞,并设置空白对照。通过MTT法,检测乳腺癌细胞和成骨细胞和的生长情况,研究复合骨水泥浸提液中唑来膦酸的药物活性及不同浓度唑来膦酸对成骨细胞的影响。结果：从复合骨水泥中释放出的唑来膦酸能对乳腺癌细胞发挥细胞毒性作用,抑制其生长。这种效果在唑来膦酸复合量不大于80mg时,随着复合量的增多而增强,其最高抑制率为60.4%。对于成骨细胞,浓度为10-5M的唑来膦酸对成骨细胞的增殖存在明显抑制作用,而10-11M组存在一定的促进作用。10-7M组和10-9M组与空白对照组比较,四天均无统计学差异。洗提液组中,第21天组于第5天和空白对照组出现统计学差异,显示出了促进成骨细胞增长的作用。其余各组在各个测试时间点,与空白对照组无统计学差异。结论：从复合骨水泥中释放出来的唑来膦酸仍具有药物活性。低浓度的唑来膦酸(10-11M)对成骨细胞的增殖有促进作用,高浓度的唑来膦酸(10-5M)对成骨细胞的增殖有抑制作用。对乳腺癌细胞的生长有明显抑制作用,且随着唑来膦酸复合量的增加而增强。