肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最为常见的恶性肿瘤之一,具有很高的发病率和死亡率。尽管近年来肝癌的基础研究和临床治疗均取得了显著的进步,但是肝癌患者的长期生存率和术后复发率并没有得到很好的改善,肝癌诊治仍面临严峻的挑战。线粒体是维持细胞正常生理活动非常重要的细胞器。正常情况下,线粒体不断进行融合与分裂,并保持动态平衡。根据条件的不同,线粒体分裂扮演着从引起凋亡到促进增殖的不同角色,与肿瘤发生发展密切相关。线粒体分裂主要由动力相关蛋白Drp1调控。已有研究发现,Drp1在乳腺癌、肺癌及胰腺癌中表达量上调,并可能通过调控细胞增殖和凋亡,促进肿瘤的形成。第一部分线粒体动力相关蛋白Drp1在肝癌中高表达并促进肝癌细胞生长目的:线粒体融合分裂异常与肿瘤发生发展密切相关。相比线粒体融合蛋白,目前对于调控线粒体分裂的Drp1的研究还没有很透彻,其参与肿瘤发生发展的具体机制尚不清楚。本部分研究将通过对肝癌临床标本的分析,探讨Drp1表达量与肝癌发生发展的关系,并通过分子生物学实验明确Drp1对肝癌细胞增殖、凋亡的影响,进而探究其作用机制。方法:通过RT-qPCR、组织芯片免疫组化染色、蛋白质印迹(Western Blot)检测肝癌组织与癌旁组织中Drp1的表达水平,并结合临床病理资料分析;使用siRNAs干扰肝癌细胞株HCCLM3、Huh7,建立敲低Drp1表达的细胞模型;使用慢病毒转染肝癌细胞株HepG2与正常肝脏细胞株QSG-7701,建立过表达Drp1的细胞模型;通过EdU实验、CCK-8实验、克隆形成实验分别检测敲低Drp1表达与过表达Drp1后细胞增殖能力;通过流式细胞计数分别检测敲低Dr]p1表达与过表达Drp1后细胞凋亡情况。结果:RT-qPCR、组织芯片免疫组化染色、蛋白质印迹(Western Blot)检测结果显示,肝癌组织中Drp1的表达水平明显高于对应癌旁组织。结合临床病理资料分析,发现肝癌组织中Drp1的表达水平与肿瘤大小、组织学分级成正相关。EdU实验、CCK-8实验、克隆形成实验、流式细胞计数检测结果显示,敲低Drp1表达抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。过表达Drp1表达促进肝癌细胞增殖,不会引起肝癌细胞凋亡。结论:肝癌组织中Drp1表达水平较癌旁组织显著升高,其表达水平同肿瘤大小与组织学分级相关。Drp1的表达可维持和促进肿瘤细胞的生长与转化。第二部分线粒体动力相关蛋白Drp1通过局限性的线粒体外膜透化引起DNA损伤并促进肝癌发生发展目的:线粒体融合分裂与细胞凋亡密切相关。Drp1调控的线粒体分裂参与线粒体外膜透化的调控过程,但其与肿瘤细胞的生长转化的关系尚不清楚。本部分研究将探究肝癌细胞中Drp1上调引起的线粒体分裂与局限性的线粒体外膜透化的关系,明确其促进肿瘤形成的机制。方法:使用慢病毒转染肝癌细胞株HepG2与正常肝脏细胞株QSG-7701,建立过表达Drp1的细胞模型;通过蛋白质印迹(WestemBlot)与免疫荧光染色检测过表达Drp1细胞中线粒体外膜透化情况;通过Caspase-3检测试剂盒与活性肽段捕获检测过表达Drp1细胞中Caspase-3通路激活情况;通过EdU实验、CCK-8实验、克隆形成实验检测抑制Caspase-3通路后细胞增殖能力;通过彗星实验检测过表达Drp1细胞中DNA损伤情况,并对相关通路进行验证;通过组织芯片免疫组化染色分析肝癌组织中DNA损伤情况与Drp1表达水平的关系;分析TCGA数据库中Drp1表达水平与肝癌患者生存预后的关系。结果:蛋白质印迹(WestemBlot)与免疫荧光染色检测检测结果显示,过表达Drp1引起细胞内局限性的线粒体外膜透化,释放Cytochromec。从线粒体中释放到细胞质的Cytochrome c激活下游Caspases通路。抑制Caspases通路显著抑制过表达Drp1稳转细胞的增殖水平。过表达Drp1通过Caspases通路的激活,剪切ICAD,激活CAD,最终引起DNA损伤。TCGA数据库的分析结果发现,肝癌患者基因拷贝数改变频率、总生存期与无瘤生存期同Drp1表达水平正相关。结论:过表达Drp1引起局限性的线粒体外膜透化,激活Caspases通路,促进和维持肿瘤细胞的生长转化。过表达Drp1通过Caspase通路引起DNA损伤,导致基因组不稳定,促进肿瘤形成发展。