TRPM2在原代角膜上皮细胞调控NLRP3炎症小体激活中的作用研究

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目的:研究在高渗条件下,原代人角膜上皮细胞(PHCECs)中瞬时感受器电位M2型(TRPM2)对NLRP3炎症小体所介导的炎症因子释放的作用。  方法:首先分别用Real-time PCR和Western blot检测等渗组(310m0sm)和高渗组(500m0sm)中TRPM2、NLRP3炎症小体各聚合成分(NLRP3、Caspase-1、ASC)、炎症因子IL-1β各自的基因表达量。第二,设四个组,分别为等渗组、髙渗组、高渗+二甲基亚枫(DMS0)组、高渗+TRPM2抑制剂(N-(p-amylcinnamoyl) anthranilic, ACA)组,用Real-time PCR检测各组TRPM2、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA基因表达量,Western blot和免疫荧光检测TRPM2、NLRP3、Caspase-1和 IL-1β的蛋白表达情况,用 Caspase-1活性试剂盒检测细胞中Caspase-1的活性程度,以此反映ACA20uM的预处理对500m0sm高渗刺激PHCECs的作用。第三,设计合成靶向人TRPM2的干扰RNA,转染至PHCECs后再予500m0sm高渗刺激,同时设等渗、高渗对照组和阴性转染对照组共四组,用Real-time PCR、Western blot、免疫荧光方法检测细胞中TRPM2、NLRP3炎症小体聚合成分和IL-1β的基因、蛋白表达。第四,设五个组,分别为等渗组、髙渗组、髙渗+TRPM2抑制剂(ACA)组、TRPM2激动剂(H202)组、H202+ACA组,用Real-time PCR检测 TRPM2、NLRP3炎症小体聚合成分和IL-1β的mRNA基因表达量;设三个组,分别为等渗组、高渗组、高渗+H202组,用Western blot检测TRPM2、NLRP3炎症小体聚合成分和IL-1β的蛋白表达情况,以此考察TRPM2激动剂H202对500m0sm髙渗刺激PHCECs的作用。  结果:  1.在高渗环境中原代角膜上皮细胞TRPM2、NLRP3、Caspase-1, ASC、IL-1β的表达升高。Real-time PCR检测结果:与310m0sm等渗组相比,500m0sm髙渗刺激组细胞TRPM2、炎症小体三个组分NLRP3、Caspase-1、ASC和炎症因子IL-1β的mRNA表达量显著上升。这说明TRPM2表达在角膜上皮,在500m0sm高渗环境压力下表达上调,且与炎症小体和炎症因子的表达变化趋势一致。  2. TRPM2抑制剂能够下调高渗引起的NLRP3炎症小体和炎症因子IL-1β>的基因和蛋白表达水平变化。Real-time PCR检测结果显示TRPM2抑制剂ACA预处理细胞能抑制高渗刺激引起的TRPM2、NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β的mRNA表达上调。Western blot与免疫荧光结果进一步提示TRPM2抑制剂ACA能够抑制高渗刺激引起的PHCECs TRPM2、炎症小体聚合成分NLRP3、Caspase-1和炎症因子IL-1β的蛋白表达上调。以上结果提示TRPM2可能对NLRP3炎症小体以及炎症因子IL-1β的表达起调控作用。  3.通过siRNA干扰原代角膜上皮细胞中TRPM2的表达后,NLRP3炎症小体以及炎症因子的基因和蛋白表达水平下降。Real-time PCR检测结果显示在siRNA干扰TRPM2的表达后,高渗刺激引起的细胞内NLRP3、Caspase-1, ASC和IL-1β的mRNA表达上调被明显抑制。Western blot和免疫荧光结果进一步显示沉默TRPM2可以逆转高渗刺激所引起的NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β的蛋白表达上调。4. TRPM2激动剂可以进一步上调下游NLRP3炎症小体和炎症因子IL-1β的表达。Real-time PCR结果显示TRPM2激动剂H202可以引起细胞内TRPM2、NLRP3、Caspase-1、ASC和炎症因子IL-1β的mRNA表达量显著上升,而TRPM2抑制剂ACA则抑制了 TRPM2、NLRP3、Caspase-1. ASC和IL-1β的mRNA表达。Western blot结果显示TRPM2激动剂的预处理可以进一步上调髙渗刺激引起的TRPM2、NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白过表达。  结论: PHCECs在高渗刺激条件下,TRPM2生成会增多,随后激活NLRP3炎症小体,分泌更多活性IL-1β,此过程中TRPM2、NLRP3和 IL-1β出现有序性信号传导,表明TRPM2-NLRP3-IL-1β信号通路可能对干眼炎症反应起到了一定作用。
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