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心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心室重构被认为是心力衰竭及心源性猝死发生的主要机制。目前对于心室重构的治疗,除了重建血供,限制梗死范围,早期药物干预和治疗仍是主要手段。作为映山红花中提取的有效部位,映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)在心脑急性缺血再灌注损伤中有重要保护作用,但对慢性心肌缺血尤其是心梗后心室重构作用并不清楚。TFR含映山红素、芦丁、槲皮素及金丝桃苷等黄酮化合物,而黄酮类化合物通过调节心脏尾加压素Ⅱ受体(urotensin Ⅱ receptor,UTR)途径和阻断Rho相关的卷曲螺旋激酶(Rho associated coiled coil-forming kinase,ROCK)活性发挥抗炎、抗氧化和抗纤维化效果。因此,我们推测TFR对梗死后慢性心室重构可能具有相似的抗纤维化作用。本研究拟探讨TFR是否可改善心梗后心室重构的作用,并重点研究TFR作用与UTR,ROCK的相互关系。实验目的:1.在体水平研究TFR对大鼠心梗后心室重构和心功能失调的影响;2.细胞水平观察TFR对h UⅡ诱导的原代乳鼠心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖的影响,探讨TFR发挥作用的UTR-Roh A-ROCK机制,进一步明确下游的MLCP路径及是否与钙离子作用有关。3.离体血管水平观察TFR对不同血管张力的影响,探讨其选择性舒张大鼠冠状动脉和改善梗死区心肌灌注的可能性;实验方法:1.大鼠左冠状动脉前降支结扎致MI模型,连续30 d的30~120 mg/kg TFR灌胃处理,术后1 d和4 w超声心动图检测左心功能和室壁厚度,实验结束后处死大鼠,称其体重和心脏重量,在结扎线以下离断心脏,一半用于形态学检测:苏木素-伊红(HE)染色观察心肌细胞的横切面积,天狼猩红染色观察间质纤维化;另一半Western blot检测心肌组织中UTR,Rho A,ROCK1和ROCK2蛋白的表达。2.原代乳鼠心肌细胞和成纤维细胞培养,加入不同浓度h UⅡ和TFR,酶标仪检测细胞活力,取100 n M h UⅡ诱导细胞重构,免疫荧光观察TFR 10,30和90 mg/L预处理后细胞形态变化,RT-PCR检测心肌细胞肥大基因ANP m RNA和β-MHC m RNA,Western blot检测成纤维细胞标志性蛋白α-SMA和SM22α表达水平,检测细胞UTR,Rho A,ROCK1和ROCK2及下游p-MYPT1,p-MLC蛋白表达水平。钙成像仪检测TFR预处理后细胞内相对钙离子含量变化。3.si RNA分别下调心肌细胞和成纤维细胞中ROCK1和ROCK2表达水平,观察TFR预处理效果与下调ROCK1和ROCK2间的相互关系。4.分别分离大鼠冠状动脉,肠系膜上动、静脉,腹主动脉和门静脉血管,制备合适血管环,依次加入各浓度梯度的TFR 3.3~2430 mg/L,检测血管张力变化。利用激光散斑血流成像仪观察静脉注射TFR(30 mg/kg)对正常或MI大鼠在体心脏表面左室心尖区域的平均血流灌注量影响。实验结果:1.与假手术组相比,MI模型组大鼠心脏LVIDs,LVIDd,LVPWs和LVPWd增加,LVFS和LVEF降低,用TFR 30,60和120 mg/kg/d或氨氯地平4 mg/kg/d治疗4 W后可以改善心梗后大鼠上述心功能指标。2.模型组大鼠的心脏重量指数(HWI)显著升高,用TFR 30,60和120 mg/kg/d处理后指数逐步降低;TFR 30~120 mg/kg和4 mg/kg氨氯地平处理后显著降低心肌细胞平均横截面积和左心室壁心肌纤维化的程度。3.TFR 30,60和120 mg/kg/d治疗后可明显抑制MI后非梗死区纤维化相关因子如α-SMA,TGF-β1,MMP2和胶原蛋白I水平的上调;MI诱导的UTR,GTP-Rho A,ROCK1和ROCK2蛋白表达水平上调效应也被显著削弱。4.10,30,90 mg/L TFR能剂量依赖性地抑制100 n M h UⅡ诱导的心肌细胞表面面积变大和成纤维细胞纤维网形成,减弱胞内绿色荧光强度,不同程度地抑制心肌细胞中促肥大基因β-MHC m RNA和ANP m RNA表达水平和成纤维细胞中α-SMA和SM22α的蛋白表达水平。5.10~90 mg/L TFR分别预处理心肌细胞后,不同程度抑制100 n M h UⅡ诱导的UTR,GTP-Rho A,ROCK2及p-MYPT1,p-MLC蛋白水平上调;阳性对照药SB 706375对蛋白表达水平的作用结果相似于高剂量TFR组。TFR对100 n M h UⅡ诱导成纤维细胞增殖后UTR-Rho A-ROCK通路的影响类似于心肌细胞,不同的是,能抑制ROCK1蛋白水平上调,对ROCK2蛋白水平无显著影响。6.ROCK2-si RNA预处理心肌细胞后可明显削弱100 n M h UⅡ诱导的细胞表面面积增大和胞内绿色荧光增强,抑制促肥大基因β-MHC m RNA和ANP m RNA的显著表达,而si ROCK1预处理并没有产生相类似结果;90 mg/L TFR预处理效应同ROCK2-si RNA。TFR联合ROCK2-si RNA后,细胞表面面积和促肥大基因表达水平进一步减小,而TFR联合ROCK1-si RNA后类似抑制效应仍然存在。7.ROCK1-si RNA预处理成纤维细胞后可明显抑制100 n M h UⅡ诱导的纤维网形成和胞内绿色荧光变强,下调促纤维标志蛋白α-SMA和SM22α显著表达,而ROCK2-si RNA预处理并没有产生相一致效应。90 mg/L TFR预处理结果与ROCK1-si RNA相类似。TFR联合孵育ROCK1-si RNA后,抑制作用愈明显;联合孵育ROCK2-si RNA后抑制作用同样存在。8.100 n M h UⅡ诱导乳鼠心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖后,Fluo-8 AM标记的钙荧光强度显著增强,相对钙离子含量增加。10,30和90 mg/L TFR分别预处理后可不同程度减弱h UⅡ诱导的高荧光强度,相对钙离子浓度也呈倍数降低。9.急性MI后,大鼠梗死区的血流灌注成像图可见黄色区域增加,红色区域减少;相应的实时动态平均血流量曲线显著下降,平均血流变化率达64.6±18.7%;静脉给予TFR 30 mg/kg后,黄色区域变少,相应的实时动态平均血流量曲线有所上升,平均血流变化率为45.6±13.5%。但对假手术组大鼠而言,TFR使用前后血流灌注量和平均血流量曲线均没有显著差异。10.3.3~2430 mg/L TFR对MI后冠状动脉产生的舒张效应明显减弱,EC50从331.8±7.2 mg/L增加至480.1±1.8 mg/L、Emax从97.4±3.7%下降为90.9±1.9%。11.浓度递增加入3.3~2430 mg/L TFR后,可不同程度舒张由U46619、苯肾上腺素和高钾诱导的冠状动脉收缩效应,TFR对保留内皮和去内皮冠状动脉的舒张反应不同,低浓度时呈内皮依赖性舒张。由U46619预收缩的TFR舒张效应EC50分别为331.8±7.2 mg/L和469.7±2.5 mg/L、最大舒张率Emax分别为97.4±3.7%和95.0±2.8%;由PE预收缩的TFR舒张效应EC50较U46619预收缩的均有明显上升(P<0.01),Emax均有显著下降(P<0.01);由高钾预收缩的TFR舒张效应EC50进一步增加,但Emax无进一步下降(P>0.05)。12.U46619预收缩大鼠肠系膜上动脉的TFR舒张效应EC50较冠状动脉有相应增加(P<0.01),Emax也有相应减少(P<0.01);而预收缩大鼠腹主动脉的TFR舒张效应EC50进一步升高(P<0.01),Emax进一步下降(P<0.01)。结论:1.TFR可有效抑制大鼠心梗后心室重构并改善左心功能;2.TFR改善h UⅡ诱导的心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖可能与钙离子依赖的UTR-Rho A-ROCK-MLCK阻断机制有关。其中,RCOK2是逆转心肌细胞肥大的关键靶点;而RCOK1则在成纤维细胞增殖中扮演更重要角色;3.TFR可选择性舒张离体大鼠冠状动脉,提高急性心梗后梗死区心肌血流灌注。