嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila AH)是一种重要的水生生物病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,也是重要的人畜共患病病原菌,可通过水源性、食源性传播和伤口感染的方式引起人的肺炎、败血症和食物中毒等病症,其公共卫生学意义引起国内外广泛关注和高度重视。近年来该菌耐药性不断上升并呈现较严重的多重耐药性,其耐药问题已成为影响水产养殖业发展和人类健康的重要因素。近年来,学者阐明了整合子一基因盒系统的存在,整合子既广泛分布在革兰氏阴性菌中,也在革兰氏阳性菌中存在,细菌在整合酶的作用下捕获外来耐药基因,耐药基因在位于整合子上游的启动子作用下表达,使细菌具有耐药及多重耐药性。整合子常以耐药菌株的质粒或转座子为载体,能使耐药基因在细菌的种内与种间传播,加速了耐药性的扩散。本试验旨在探究整合子一基因盒系统在耐药嗜水气单胞菌中的分布、结构与功能,讨论该菌多重耐药表型和整合子/基因盒系统的相关性。运用生物信息学分析可变区基因盒序列和结构,致力于了解整合酶位点参与耐药基因的捕获和切除方式,为整合子在该菌耐药基因的水平传播动力学研究奠定基础。本研究对2008-2011年采集的江西省规模化水产养殖场的患病中华鳖和黄鳝等病料进行细菌分离,经菌落和菌体形态观察,培养特性,生化鉴定,毒力因子和PCR检测鉴定,共分离到18株嗜水性单胞菌。为了解嗜水气单胞菌江西分离株的耐药表型和特性,本研究采用K-B纸片法检测18株嗜水气单胞菌对21种抗生素的敏感性,结果表明10株中华鳖嗜水气单胞菌同时耐13～20种不等抗生素药物,其平均多重耐药率为76.7%。8株黄鳝分离菌有6株菌耐16～21种抗生素,1株耐13种的多重耐药,1株分离菌耐5种抗生素药物,其平均多重耐药率达75.6%,表明分离菌出现了严重的多重耐药性,其不同来源菌株的多重耐药率差异不大。通过WHONET5.4解释表和散点图分析分离菌对环丙沙星、左氧氟沙星、多西环素与四环素的耐药谱,高度耐四环素的菌株对多西环素存在较严重的交叉耐药,对环丙沙星、左氧氟沙星存在一定程度的交叉耐药。基于整合子在细菌耐药机制中的重要作用,本研究对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila AH)的整合子/基因盒系统进行检测并对结构特征进行分析。根据Genbank所公布的整合子保守序列,运用primer premier5.0和Oligo6.0等生物软件对Ⅰ类、Ⅱ类整合酶基因,整合子可变区、整合子3端的耐磺胺类和季氨盐类药物的qacE△1-sull基因设计特异性引物,对18株嗜水气单胞菌进行PCR检测。对阳性扩增产物进行纯化、测序和分析。结果表明,其中6株分离菌Ⅰ类整合酶阳性,16株分离菌Ⅱ类整合酶阳性,2株黄鳝分离菌Ⅰ和Ⅱ类整合酶均为阴性。Ⅰ和Ⅱ类整合酶基因与GenBank公布的Ⅰ和Ⅱ类整合酶基因序列同源性分别99.6%和99.4%以上,Ⅰ和Ⅱ类整合酶基因序列的同源性为22.1%,表明为两种不同类型的整合子。为研究嗜水气单胞菌多重耐药表型和整合子/基因盒系统的相关性。对整合子可变区进行扩增,最后扩增出5种不同大小的基因盒,片段长度分别为1452bp(InI-A)、1530bp (InI-B)、1238bp (InI-C)、1840bp(InI-D)和2478bp(InI-E)。利用Genbank和DNAstar等软件对相关序列进行比对并分析其功能,发现lnI-A和InI-B都携带acc-(6’)-Ib-cr和arr-3基因盒,基因盒分别介导细菌对氨基糖苷类、喹诺酮类和利福平耐药。InI-C携带GGDEF家族蛋白或二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase, DGC),催化GTP合成c-di-GMP发挥多种生物功能。InI-D携带aadA2、orfF和dfrA12,分别介导细菌对氨基糖苷类、未知蛋白和甲氧苄啶的耐药。InI-E携带cmlA6和aadA2基因盒,分别介导细菌对氯霉素和氨基糖苷类耐药。结合嗜水气单胞菌对抗生素的耐药表型分析,表明多重耐药菌株与其携带Ⅰ型和Ⅱ型整合子及基因盒之间存在一定关系。为了解整合酶位点参与耐药基因的捕获和切除方式,经生物信息学分析,表明整合子可变区InI-A中存在aatC(59bp)、aat11和aatI2三个重组位点,后两者的核心序列相同,但aatI2在核心位点"CCCTAAA"缺失一个碱基T。且aatI1、aatI2和attC序列与肺炎克雷伯菌(GenBank accession EU543272)的整合子整合位点序列同源性达到了99%以上。推测耐药基因acc-(6’)-Ib-cr在特异的整合位点aatI1和aatC(59bp)结构之间被整合,arr-3基因在aatC(59bp)和aatI2结构之间被整合。