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目的体外建立TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型,研究RhoGTP酶在TNF-α诱导内皮细胞损伤中的作用及机制。方法购买人脐静脉内皮细胞(HUVECs)贴壁培养。采用siRNA技术在HUVECs中分别沉默RhoA、Rac1、Cdc42的基因表达,通过RT-PCR法鉴定RhoA、Rac1、Cdc42的沉默。实验采用正常组(control)、模型组(60 ng/ml TNF-α,作用4 h),应用Western Blot技术和Pulldown assay检测RhoA、Rac1、Cdc42和Raf-1的表达及活化;采用正常组(control)、模型组(60 ng/ml TNF-α,作用4 h)、siRNA或抑制剂组、siRNA或抑制剂预处理+TNF-α处理组,应用MTT法检测细胞存活率,PI/Annexin V-FITC双染色和流式细胞仪检测细胞凋亡,应用Western Blot技术检测ROCK的表达、活化、vimentin(波形蛋白)的表达、裂解、磷酸化以及caspase3、caspase8、caspase9的活化,免疫荧光检测vimentin和phospho-vimentin的骨架形态及分布。结果1.RT-PCR结果显示:RhoA、Rac1、Cdc42的沉默鉴定成功。2.MTT法检测结果显示:沉默RhoA基因的表达可以显著提高TNF-α诱导的内皮细胞存活率。3.免疫荧光及流式细胞仪检测结果显示:沉默RhoA基因的表达可以显著降低TNF-α诱导的内皮细胞凋亡。4.Western Blot及Pulldown技术检测结果显示:TNF-α可以显著诱导RhoA的活化,而对于Rac1和Cdc42的表达及活化无显著作用,表明RhoA的活化介导了TNF-α诱导的内皮细胞损伤。5.Western Blot检测结果显示:RhoA沉默可以显著抑制TNF-α诱导的ROCK1表达及ROCK活化,表明RhoA可能是通过诱导ROCK的活化从而介导内皮细胞损伤。6.MTT法检测结果显示:ROCK抑制剂Y-27632预处理可以显著提高TNF-α诱导的内皮细胞存活率。7.免疫荧光及流式细胞仪检测结果显示:ROCK抑制剂Y-27632预处理可以显著抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡,表明RhoA/ROCK信号通路的活化介导了TNF-α诱导的内皮细胞损伤。8.Western Blot检测结果显示:沉默RhoA或Y-27632预处理可以显著抑制TNF-α诱导的vimentin裂解以及Ser56位点phospho-vimentin的表达,并显著提高Ser83位点phospho-vimentin的表达。9.Western Blot检测结果显示:Y-27632预处理可以显著抑制caspase3和caspase8的裂解,而对于caspase9无显著作用,表明RhoA沉默或ROCK抑制皆是通过抑制caspase3和caspase8的活化,从而抑制vimentin的裂解。10.免疫荧光检测结果显示:沉默RhoA或Y-27632预处理可以显著抑制TNF-α诱导的vimentin及phospho-vimentin(Ser56和Ser83)骨架形态和分布的变化,表明RhoA/ROCK信号通路可能通过调节vimentin的磷酸化来诱导vimentin及phospho-vimentin(Ser56和Ser83)骨架结构发生重排,进而参与TNF-α诱导的内皮细胞损伤。11.Western Blot检测结果显示:TNF-α可以显著诱导Raf-1的磷酸化,提示Raf-1可能介导了内皮细胞损伤。12.Western Blot检测结果显示:Raf-1抑制剂GW5074预处理对于ROCK的表达及活化无显著作用,表明Raf-1并不是通过诱导ROCK的活化来介导内皮细胞损伤的。13.Western Blot检测结果显示:Raf-1抑制剂GW5074及CK2抑制剂TBB预处理对TNF-α诱导的vimentin裂解无显著作用,但可以显著降低Ser56位点phospho-vimentin的表达,并显著提高Ser83位点phospho-vimentin的表达。14.免疫荧光检测结果显示:GW5074及TBB预处理可以显著抑制TNF-α诱导的vimentin及phospho-vimentin(Ser56和Ser83)形态和分布的变化。15.MTT法和免疫荧光及流式细胞仪检测结果显示:GW5074及TBB预处理可以显著提高TNF-α诱导的内皮细胞存活率,同时显著降低TNF-α诱导的内皮细胞凋亡,表明Raf-1/CK2通路也可以通过调节vimentin的磷酸化,以及vimentin和phospho-vimentin(Ser56和Ser83)骨架重排,进而参与TNF-α诱导的内皮细胞损伤。结论RhoA/ROCK信号通路及Raf-1/CK2通路都可以通过调节vimentin的磷酸化,以及vimentin和phospho-vimentin的骨架重排,参与TNF-α诱导的内皮细胞损伤。此外,RhoA/ROCK通路通过活化caspase3、caspase8参与TNF-α诱导的vimentin裂解。