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腺病毒载体是目前应用比较广泛的载体,由于其宿主范围广、感染性强、安全性高、外源病毒能游离表达等特点,被广泛用于制药、基因工程疫苗、基因治疗以及肿瘤治疗等领域。本实验室刘根梅等将PCV2 ORF2基因和猪IFN-γ基因经15个氨基酸的连接序列(Gly4Ser)3接头连接后转移至腺病毒骨架载体pAdEasy-1,构建出了重组腺病毒rAd-ORF2-γ-IFN(简称tAd-OI),免疫小鼠后产牛了较高水平的抗体。
鉴于此,本研究对重组腺病毒rAd-OI的免疫效力进行了探讨。通过攻毒试验检测rAd-OI的保护效力,为rAd-OI重组腺病毒疫苗的研发提供了理论基础。主要研究内容如下:
1.猪圆环病毒2型福建株的分离鉴定及全基因组序列分析采集临床表现为PMWS仔猪的腹股沟淋巴结、肺脏、脾脏等组织,充分研磨后反复冻融3次离心收集上清液进行PCR检测。经PCR检测为阳性的病料上清过滤后接种PK-15细胞连续传代,每代次均检测PCV2的扩增情况,并通过间接免疫荧光方法检测病毒的扩增情况。扩增得到的PCV2病毒液用间接免疫荧光方法测定其TCID50,结果为10-4.622/0.1mL,由此分离出了一株PCV2毒株,命名为PCV2(FJ)。设计两对特异性引物,ORF2-P1和ORF2-P2用以扩增PCV2 ORF2基因702bp,PCV2-P1和PCV2-P2用以扩增PCV2全长基因1767bp,PCR扩增产物经纯化回收后连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性菌落在LB培养基(Amp+)培养过夜,碱裂解法抽提质粒。分别进行菌液和质粒的PCR检测和质粒的双酶切鉴定,将检测阳性的菌液送上海生工生物工程有限公司测序鉴定。PCR检测结果表明PCV2全基因组均得以扩增,测序结果表明PCV2(FJ)与GenBank上PCV2FJGT0602株(GenBank:G12247991.1)同源性最高,达99.1％,在进化树上亲缘关系最近。
2.猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立和临床应用以分离出的PCV2(FJ)ORF2为目的基因,设计合成了特异性的引物和探针。PCR扩增得到目的基因,经纯化回收克隆到pMD18-T。载体,转化DH5a感受态细胞,挑取阳性菌落在LB培养基(Amp+)培养过夜,碱裂解法抽提质粒后经PCR鉴定、质粒双酶切鉴定和测序鉴定为阳性,即得到标准阳性质粒。标准阳性质粒用紫外分光光度计测定浓度并换算为拷贝数。通过对荧光定量PCR引物和探针浓度的优化、反应条件的优化,建立了PCV2实时TaqMan荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病毒(PRV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性。与普通PCR方法相比,其敏感性高出1000倍,可达102拷贝/μL。对临床样品的检测表明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏、脾等组织中的PCV2病毒。
3.表达PCV2 ORF2和猪IFN-γ基因重组腺病毒的免疫保护作用以构建的重组腺病毒rAd-OI为免疫原免疫30日龄、母源抗体为阴性的三元杂商品仔猪。25头猪随机分为5组,每组5头。A组肌注免疫tAd-OI106.3TCID50/头,B组肌注免疫rAd-OI107.3 TCID50/头,C组肌注免疫rAd-OI108.3TCID50/头,D组肌注免疫rAd-OI109.3TCID50/头,E组不作免疫,留作攻毒对照。一免后21天进行二免,二免后21天进行第三次免疫,免疫后每周采血检测抗体水平。免疫后56天(即第二次免疫后14天)所有猪攻毒PCV2(FJ),剂量为5×104.622TCID50/头。攻毒前后每周采血检测抗体水平及病毒血症情况,观察猪只的反应情况。攻毒21天后剖杀所有猪,检测组织中的病毒含量。结果显示C组的抗体水平一直显著高于其他各组,攻毒后的病毒血症也低于其他各组。结合抗体水平、免疫和攻毒后的临床症状以及病毒血症水平得出,C组的免疫剂量较为理想。
购买25头PCV2母源抗体为阴性的三元杂仔猪。试验猪随机分为5组,每组5头。A组肌注免疫rAd-OI108.3TCID50/头,B组肌注免疫重组腺病毒rAd-ORF2(简称rAd-O)108.3TCID50/头,C组肌注免疫某公司生产的猪圆环病毒灭活疫苗(圆健)1mL/头,D组不做免疫,留作攻毒对照,E组不作免疫,也不做攻毒,留作空白对照。一免后21天加强免疫一次,剂量同第一次,一免开始后每周采血检测抗体水平。免疫后42天(即第二次免疫后21天)所有组攻毒PCV2(FJ),剂量为5×104.622TCID50/头。攻毒前后每周采血检测抗体水平及病毒血症情况,观察猪只的临床反应情况。攻毒21天后剖杀所有猪,检测组织中的病毒含量。结果显示,C组的抗体水平最高,A组次之,B组最低,但C组的病毒含量却高于A组,说明重组腺病毒rAd-OI作为免疫原具有较好的免疫保护作用,这些结果为重组腺病毒rAd-OI疫苗的研制开发提供了理论基础。