结核病是目前世界范围内流行范围最广、致死率最高的的传染性疾病之一。全球每年新增近千万感染者,并造成近百万人死亡。结核分枝杆菌是结核病的致病菌,它能够产生多种致病因子,具有强致病性；同时具有多重耐药性和免疫逃逸能力,对寄生环境有极强的适应能力。因此,结核分枝杆菌一直都是对人类健康威胁最大的致病菌之一。近年来,对结核分枝杆菌致病性和耐药性的研究取得了较大的进展,越来越多与之相关的蛋白被发现。在本论文中,我们对分枝杆菌致病因子分泌系统ESX-1的调节蛋白MycP1以及结核分枝杆菌外膜蛋白RV1698开展结构生物学研究,用X-射线晶体衍射方法解析了它们的三维结构,并探究了结构与功能之间的关系,初步阐释了这两个蛋白质在分枝杆菌致病过程中的作用机制。本论文的第一部分是分枝杆菌ESX-1分泌系统调节蛋白MycP1的结构生物学研究。结核分枝杆菌中存在一种新型分泌系统T7SS (Type Ⅶ secretion system,), ESX-1系统就是一种典型的T7SS,也是分枝杆菌中研究最广泛的分泌系统。ESX-1分泌系统是分枝杆菌致病性的决定因素之一,致病性分枝杆菌在感染宿主细胞的过程中会通过ESX-1系统分泌致病性蛋白ESAT-6和CFP-10,通过抑制巨噬细胞内吞噬小体的成熟和细胞因子信号、抑制Toll样受体信号通路、在吞噬小体表面形成通道以促进细菌扩散等作用机制促进病菌侵染过程。MycP1是ESX-1系统的组成蛋白之一,对ESX-1系统有双重调控作用：一方面MycPl是维持ESX-1系统完整性所必须的,它的缺失会导致ESX-1系统丧失对ESAT-6/CFP-10的分泌功能；另一方面,MycP1对ESX-1系统的活性具有负调控作用,MycP1活性的缺失可以促进ESX-1系统对ESAT-6/CFP-10的分泌。MycP1的双重调节作用的意义可能在于维持分枝杆菌致病性与免疫原性之间的平衡,避免细菌在侵染宿主细胞的过程中激发宿主过强免疫反应。实际上,MycP1是一种subtilisin-like的丝氨酸蛋白酶,具有跨膜结构,研究证实MycP1对ESX-1系统的负调控是通过降解其天然底物EspB实现的。我们所感兴趣的是,MycP1蛋白作为一个具有双重调控作用的丝氨酸蛋白酶,它在结构上有没有特殊性,在功能上与EspB蛋白相互作用的机制是什么,它又是如何行使双重调控功能的。我们成功地解析了耻垢分枝杆菌中MycP1蛋白(MycP124-422)的晶体结构,分辨率为2.15A。结构表明MycP1具有典型的类似subtilisin的丝氨酸蛋白酶的折叠模式,包含标志性的催化三联体Asp-His-Ser。但与subtilisin家族的丝氨酸蛋白酶不同,MycP1蛋白氨基端被定义为propeptide的序列是无序结构,并且不能被蛋白自身切除。为了进一步研究propeptide在MycP1蛋白结构与功能中的作用,我们表达并纯化了切除这一序列的MycP1蛋白(MycP163-422),并解析了它的晶体结构,分辨率为2.25A。MycP124-422和MycP163-422在三维结构上并没有显著差别,蛋白核心结构域的构象也不受propeptide切除的影响。相关生化实验结果表明,propeptide不会抑制核心结构域的活性,相反的,该序列的缺失反而导致MycP1的蛋白酶活性略微下降。上述研究结果表明,MycP1蛋白的‘"propeptide"序列并不具有经典的propeptide的结构与功能,并不符合经典的propepide的定义。分子动力学模拟的结果表明,MycP1蛋白的"propeptide"在功能上具有维持MycP1蛋白核心结构域构象稳定,从而维持其蛋白酶活性的作用。本文的第二部分是结核分枝杆菌外膜蛋白Rv1698的结构研究。结核分枝杆菌具有复杂的包膜结构,通透性极弱,是保护细菌的一道天然屏障,也是致病性所必须的。在同样具有包膜结构的革兰氏阴性菌中,外膜蛋白行使着细菌跨越包膜与外界物质交换的功能。在结核分枝杆菌中,已鉴定了三个外膜蛋白——OmpATb、Rv1698和Rv1973;而在整个分枝杆菌家族中,目前只有结核分枝杆菌的外膜蛋白OmpATb和耻垢分枝杆菌的外膜蛋白MspA的结构被解析出来。对于Rv1698蛋白,研究表明它与结核分枝杆菌的致病性有密切关系,参与细菌对外界营养物质的摄取,是抗生素进入细菌胞内的重要通道。也有研究认为Rv1698蛋白可能参与结核分枝杆菌体内铜离子的外排。我们运用X-射线晶体衍射方法解析了Rv1698蛋白截短体(Rv169827-314)分别在含有和不含去垢剂C12E8的条件下的晶体结构,分辨率分别为2.3A和3.15A。晶体结构显示,Rv169827-314蛋白并不具有经典β-barrel通道结构,而是α/β结构模式,包含一个羧基端的球形结构域和一个氨基端长约70A、向外延伸的α-螺旋。相关生物化学和生理学实验表明,预测为信号肽的氨基端跨膜序列在生理状态下的成熟蛋白中并未被切除,而且对于Rv1698蛋白的膜定位和多聚化有重要作用,在多聚化的Rv1698蛋白中可以检测到通道活性。我们认为Rvl698蛋白可能通过自身的多聚化来形成通道结构,氨基端跨膜螺旋是影响蛋白多聚化的一个关键因素,并且参与通道的形成。Rv1698具有特殊的结构模式,可能代表着结核分枝杆菌外膜上一类新的通道蛋白结构,但这类蛋白的通透性特点和机制仍有待进一步研究。