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研究背景:调控细胞周期阻滞和细胞凋亡的锌指蛋白(zinc finger protein which regulates apoptosis and cell cycle arrest,ZAC)基因是一种抑癌基因,其定位于人类染色体6q24-25。ZAC基因所编码的蛋白是具有7个锌指结构域的转录因子,其可诱导细胞凋亡和细胞Gl期阻滞,从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。锌指是ZAC蛋白的DNA结合结构域。ZAC不仅可以作为转录因子,而且可以作为p53和其它核受体的转录辅因子,抑制肿瘤细胞生长。但其作用机制不明。研究目的比较ZAC和锌指缺失ZAC(ZAC△ZF)质粒转染对胃癌细胞增殖的效应,探讨锌指在此过程的作用及其机制。材料与方法1.ZAC及ZAC△ZF真核表达载体的鉴定将ZAC以及ZAC△ZF质粒转化至大肠杆菌DH5α,提取目的DNA质粒,进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。2.实验分组将胃癌细胞BGC823和SGC7901随机分为4组:实验组为2组,分别用LipofectamineTM 2000转染试剂转染ZAC质粒和ZAC△ZF质粒;对照组为空质粒转染和无转染。转染后,分别培养24h、48h和72h。3.ZAC及ZAC△ZF对胃癌细胞增殖的效应应用MTT技术,分别检测4组细24h、48h和72h的细胞增殖。4.ZAC及ZAC△ZF对胃癌细胞系ZAC及ac K14-H3免疫反应性的效应应用荧光免疫组织化学技术,分别检测4组细胞ZAC及ac K14-H3的免疫反应性(immunoreactivity,IR)。5.ZAC及ZAC△ZF对胃癌细胞ZAC免疫沉淀复合物的效应应用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)-PAGE-银染技术,检测4组细胞ZAC IP复合物的成分。6.统计学处理所有的实验数据都是用均数±标准差((?)±S)来表示,应用SPSS17.0统计软件进行处理数据,两组比较采用t检验,多组比较采用方差分析,并采用SNKt检验进行多重比较,P<0.05为差异性有统计学意义。结果:1.ZAC和ZAC△ZF真核表达载体的鉴定琼脂糖凝胶电泳分析显示,ZAC以及ZAC△ZF质粒DNA片段长度与预期一致。ZAC以及ZAC△ZF质粒序列分析结果与Gen Bank序列一致。2.ZAC及ZAC△ZF对胃癌细胞增殖的效应胃癌细胞SGC-7901培养24h、48h和72h后4组细胞的A值分别为:对照组,0.575±0.021、0.755±0.046和0.886±0.031;空质粒组,0.542±0.035、0.698±0.026以及0.756±0.018;ZAC组,0.286±0.015、0.203±0.018和0.155±0.013;ZACΔZF组,0.305±0.029、0.258±0.031和0.209±0.011。胃癌细胞BGC823培养24h、48h和72h后4组细胞A值分别为:对照组,0.712±0.021、0.841±0.019和0.933±0.050;空质粒组,0.675±0.018、0.758±0.023和0.836±0.006;ZAC组,0.375±0.015、0.238±0.024和.161±0.018;转染ZACΔZF质粒组分别为:0.401±0.031、0.316±0.038以及0.208±0.0210。结果显示,实验组与对照组进行比较,实验组的细胞增殖能力明显下降(P<0.01)。结果表明,ZAC质粒和ZAC△ZF质粒均可抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖,尽管ZAC△ZF的抑制效应较ZAC弱,但二者无显著性差异(P>0.05)。3.ZAC及ZAC△ZF对胃癌细胞ZAC及ac K14-H3免疫反应性的效应BGC-823细胞对照组组、空质粒组、ZAC组和ZACΔZF组ZAC IR分别为0.386±0.016、0.391±0.018、0.713±0.031和0.684±0.012;SGC-7901细胞分别为0.457±0.038、0.481±0.021、0.732±0.019和0.699±0.026。对照组平均阳性细胞率均显著低于实验组(P<0.01),但ZAC组与ZAC△ZF组无显著性差异(P>0.05)。BGC-823细胞对照组组、空质粒组、ZAC组和ZACΔZF组ac K14-H3 IR分别为0.451±0.028、0.510±0.019、0.707±0.034和0.678±0.021;SGC-7901细胞分别0.508±0.022、0.544±0.031、0.746±0.017和0.712±0.014。结果显示,对照组的平均阳性细胞率均显著低于实验组(P<0.01);但ZAC组与ZAC△ZF组无显著性差异(P>0.05)。4.ZAC及ZAC△ZF对胃癌细胞ZAC IP复合物的效应4组细胞ZAC IP复合物的带型相同,均显示3条主带。根据分子量的大小,3条主带分别命名为带1、带2和带3。SGC-7901细胞,对照组组、空质粒组、ZAC组和ZACΔZF组带1灰度值分别为0.890±0.016、0.866±0.031、1.026±0.008和0.922±0.016;带2分别为0.758±0.013、0.761±0.022、0.923±0.015和0.868±0.032;带3分别为0.699±0.24、0.702±0.012、0.878±0.017和0.841±0.018。BGC-823细胞,对照组组、空质粒组、ZAC组和ZACΔZF组带1灰度值分别为0.882±0.016、0.841±0.024、1.101±0.017和0.891±0.021;带2分别为0.757±0.019、0.762±0.018、0.911±0.013和0.869±0.012;带3分别为0.679±0.032、0.687±0.029、0.862±0.028和0.834±0.015。结果显示,3个主带灰度值,ZAC及ZAC△ZF组显著大于空质粒组和对照组(P<0.01);但ZAC与ZAC△ZF组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:1.ZAC和ZAC△ZF均可抑制胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖,尽管ZAC△ZF活性较ZAC弱,但二者间无显著性差异。2.ZAC和ZAC△ZF均可上调胃癌细胞组蛋白H3的乙酰化,二者无显著性差异。3.ZAC和ZAC△ZF转染后ZAC IP复合物成分相同。