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研究目的:冠心病具有极高的死亡概率。对于目前来说,治疗缺血性心脏病最有效最直接的疗法是心肌再灌注治疗疗法,其能够有效地减少心肌细胞的死亡,尽可能地挽回心脏功能。然而,不管在临床或科研研究也发现了对缺血的心肌进行再灌注治疗时,再灌注的心肌没有得到像人们预期的恢复,反而受到了进一步的损伤,即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。由此可见,研究如何预防,减轻甚至消灭心肌缺血再灌注损伤,成为了治疗缺血性心脏病的一道重要关卡。具目前可知的研究表示,治疗缺血性心脏病导致的MIRI是由许多机制做成的。大致可分为氧化应激,炎症作用,血管内皮功能障碍导致的血小板功能异常,冠状动脉内皮的功能障碍等或多或少都参与了MIRI的损伤机制。这些因素都可以相辅相成地促进损伤的发生。面对现时的治疗困境,国内外的医学家专门提出了各种治疗方法,例如,缺血后适应(ischemic postconditioning IPoc)和缺血预处理(ischemic preconditioning IPC),这些疗法在理论上得到了广泛的验证和实验,但是鉴于其操作性困难的原因,以上两种理论都难以在临床实践中被广泛应用。药物治疗已在治疗缺血性心脏病临床应用中得到了许多研究和使用基础。所以寻找一种药物来治疗和减轻MIRI当今仍然是一条可行的方法。鼠尾草酸(carnosic acid)是一种脂溶性中药,其来源来自唇形科的迷迭香属的叶子。CA已经在不同的领域上被广泛应用,在已知的研究中可得知其具有抗氧化,抗炎症,调整血脂,杀菌消毒,抗击癌症等功效。最近有学者发现了鼠尾草酸对大鼠肝脏的缺血再灌注损伤起到积极的保护作用,说明了鼠尾草酸在缺血再灌注的信号转导通路中有积极的作用。MPTP(mitochondrial permeability transition pore线粒体渗透性转变孔道)是细胞凋亡的关键步骤同时也是缺血再灌注病理生理过程中的重要角色之一。心肌缺血导致的心肌凋亡或心肌坏死都与MPTP的过度开放有密切的关系。目前有关CA作用心肌细胞MPTP的研究甚少。基于现有的研究理论基础,因此我们假设,鼠尾草酸可以通过调控凋亡信号通路,改变MPTP的过度开放,调节细胞凋亡,从而保护缺血再灌注的心肌细胞。本实验主要分为两个部分:1.通过构建大鼠心肌缺血再灌注模型同时设立不同浓度的加药组。观察鼠尾草酸的不同浓度对心肌组织的作用效果。2.通过western blot,MPTP线粒体开放测试观察线粒体开放程度等试验初步探讨鼠尾草酸是否能够通过抑制MPTP的过度开放来保护缺血再灌注损伤的心肌细胞。材料与方法:1.大鼠心肌缺血模型构建:(IR组)选取250-320克健康雄性Wistar大鼠心脏应用体外心脏灌流装置langengdorff对大鼠心脏进行离体灌流。对大鼠心脏进行30分钟停止灌流的处理,随后恢复灌注120分钟。制备出大鼠MIRI的心脏损伤模型。2.药物干预3.在进行大鼠心脏离体灌流的前5天,开始对大鼠进行皮下注射用药。(注意:鼠尾草酸粉末需要使用药用玉米油充分溶解)应用体外心脏灌流装置langengdorff对大鼠心脏进行离体灌流。对大鼠心脏进行30分钟停止灌流的处理,随后恢复灌注120分钟。制备出大鼠MIRI的心脏损伤模型。4.在使用体外心脏灌流装置langengdorff进行体外灌流时与开始,恢复灌流30分钟,恢复灌流60分钟,分别记录心率与冠状动脉流量。5.使用HE染色观察各药物浓度对心肌细胞的影响,使用TTC染色法来评估在各药物浓度影响各种的心肌细胞梗死面积6.通过钙诱导MPTP线粒体开放测试观察MPTP开放程度。7.通过western blot实验检测Bcl2,Bax,APAF-1,CYTC,Caspase3,Caspase9等MPTP上下游的关键蛋白的相关表达改变情况。8.统计学分析:两个组别之间比较实用独立样本T检验,多个样本组别之间的比较则使用单因素方差分析,如果组间存在统计学上的差异则采用LSD进行进一步的检验并进行两两比较,当P<0.05就被认为差异具有统计学意义。实验结果1.与IR组相比,各浓度的用药组的复跳心率和冠脉流量都得有不同程度的恢复,其中中度浓度药物组(100mg/kg组)比其余两组效果相对突出。2.HE染色结果显示,与缺血再灌注组相比低浓度药物组,中度浓度药物和高度浓度可以看出药物组均有保护作用,其中中度浓度药物组(100mg/kg组)比其余两组效果较为突出。TTC染色结果显示:与缺血组相比,各浓度药物组均有保护作用,其中中度浓度药物组(100mg/kg组)比其余两组效果相对突出。各药物被IR组心肌梗死面积分别减少了14%,29%,16%。因此我们选择使用浓度100mg/kg进行后续实验。4.MPTP线粒体孔道开放试验结果显示:CA100组MPTP对钙离子诱导开放敏感性最低。提示CA可减少MPTP的开发程度。5.检测MPTP上游蛋白bcl2蛋白表达上调,bax蛋白表达下降,bcl2/bax比值上升。6.检测下游蛋白APAF-1,CYTC,Caspase3,Caspase9蛋白表达均为下调,说明了鼠尾草酸是通过抗凋亡相关信号通路来介导调控凋亡的机制来保护心肌细胞。而缺血再灌注组与阻断剂组的对比中以上的蛋白均没有明显的差异。7.给与ATR治疗后心肌梗死面积升高,心肌凋亡率升高,提示CA的治疗作用可被ATR所取消。结论1.鼠尾草酸能减轻心肌的MIRI,对大鼠缺血再灌注心肌具有保护作用。2.鼠尾草酸通过调节bcl2和bax表达,进而抑制MPTP开放及其下游凋亡信号激活来实现其心肌保护作用