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肌内脂肪是猪肉品质评定的重要指标之一,猪的肌内脂肪含量与猪肉的风味、多汁性、嫩度和色泽等指标密切相关。我国地方优良品种金华猪肌内脂肪含量高,与肌内脂肪含量较低的长白猪相比,表现出优良的肉质性状。因此,金华猪和长白猪的骨骼肌可作为天然理想的肌内脂肪研究模型。m6A是真核生物中普遍存在的一类动态可逆的mRNA表观遗传修饰。已有研究发现FTO作为一种m6A去甲基化酶在介导3T3-L1细胞和猪皮下前体脂肪细胞的成脂分化及脂肪沉积中发挥了重要作用,但m6A能否调控肌内脂肪沉积及其内在的分子机制尚未见报道。因此,本试验在比较金华猪和长白猪肌内脂肪含量差异的基础上,利用免疫印迹、HPLC-MS等技术建立两种猪的肌内脂肪含量与mRNA m6A及其对应修饰酶类的关系,利用MeRIP-seq技术绘制两种猪的背最长肌m6A甲基化修饰图谱,并对比分析这两种猪肌肉的m6A修饰差异基因,挖掘出参与脂肪代谢调控的差异修饰基因并对其开展功能鉴定。旨在探讨基因的m6A修饰对猪肌内脂肪沉积的影响,为从mRNA表观遗传学角度深入研究猪肌内脂肪沉积的分子机制和优质猪肉生产提供理论依据,也为人类肥胖相关疾病研究提供借鉴。主要研究结果如下:试验一:金华猪和长白猪骨骼肌mRNAm6A修饰水平与肌内脂肪沉积的关系选取胎次相同、体重均一的180日龄纯种长白猪和金华猪,屠宰后采集背最长肌和腰大肌样本。(1)肌内脂肪沉积对比结果表明,180日龄金华猪的肌内脂肪含量显著高于长白猪(p<0.05),金华猪的肌内脂肪细胞的大小和数量均显著高于长白猪。(2)m6A修饰结果表明,金华猪肌肉的m6A修饰水平显著低于长白猪(p<0.05);金华猪肌肉的甲基化转移酶METTL3和METT14的表达量显著低于长白猪(p<0.05),而去甲基化酶FTO的表达量显著高于长白猪(p<0.05),与m6A修饰水平差异相一致。提示FTO、METTL3、METTL14介导的mRNAm6A修饰水平与猪肌内脂肪沉积负相关,推测m6A修饰可能在猪肌内脂肪沉积中发挥重要作用。试验二:金华猪和长白猪骨骼肌m6A甲基化修饰谱绘制及差异修饰基因筛选利用MeRIP-seq及生物信息学分析技术,首次绘制出金华、长白两个品种猪背最长肌的mRNAm6A甲基化修饰图谱。结果表明猪肌肉中的m6A修饰基序、分布等特征与其他已报道哺乳物种高度保守,主要体现在:(1)mRNA m6A修饰主要分布在mRNA的CDS与3’UTR上,显著富集在3’UTR与CDS的交界处;(2)m6A修饰主要发生在包含“RRACH”(R=鸟嘌呤/腺嘌呤,H=腺嘌呤/胞嘧啶/尿嘧啶)的保守序列上;(3)含m6A修饰的mRNA约占检测到的总转录本数量的1/3,每条含m6A修饰的mRNA上约有1.7个m6A富集区域(peak)。对金华猪和长白猪背最长肌的甲基化差异修饰基因进行统计:金华猪背最长肌中检测到3301个m6A修饰基因,长白猪背最长肌中检测到2978个m6A修饰基因。其中,金华猪和长白猪背最长肌中均检测到的m6A修饰基因2474个,基因的GO注释结果显示这些基因主要参与基因表达、肌肉分化发育和肌肉收缩等过程中;金华猪背最长肌特有的m6A修饰基因827个,主要参与胞内蛋白代谢、碳水化合物代谢、线粒体组成等过程中;长白猪背最长肌特有的m6A修饰基因504个,参与骨骼肌肌肉发育、血管发育等过程中。将这三类中参与脂肪代谢的m6A修饰基因进行GO注释结果显示:金华猪中含有102个特有m6A修饰基因参与到脂肪酸氧化、氧化代谢等类别中,而长白猪中无特有的m6A修饰基因富集在这一类别中。结果提示:猪背最长肌中氧化代谢相关基因的m6A修饰可能对猪肌内脂肪沉积起调控作用。试验三:MTCH2 m6A修饰对猪肌内脂肪沉积的影响及其内在机制研究MTCH2是一个参与氧化代谢的金华猪背最长肌中特有的m6A修饰基因,以猪肌内前体脂肪细胞为体外培养模型,通过构建MTCH2过表达质粒MTCH2-WT和siRNA,探究了MTCH2基因的对猪肌内脂肪前体细胞分化和脂肪沉积的影响。结果显示在猪肌内脂肪前体细胞中,过表达MTCH2显著增强了细胞内脂肪沉积(p<0.05),而干扰MTCH2则显著抑制了肌内脂肪细胞的脂肪沉积(p<0.05)。上述结果提示MTCH2的表达与猪肌内脂肪细胞的脂肪沉积呈正相关。MeRIP-seq测序图谱显示MTCH2的mRNA上有1个m6A peak,位于该基因mRNA的前1-120bp内。鉴于m6A修饰对碱基排列基序的选择特异性,预测MTCH2 第 8位碱基(5’-ATG GCG GAC GCG GCC AGT CAG GTG-3’)上可能发生m6A修饰位点。通过点突变技术,我们将MTCH2-WT质粒上该预测位点右侧胞嘧啶进行同义突变(74C→T),获得MTCH2-MUT质粒。m6A-IP-qPCR试验证实了MTCH2-MUT质粒表达的MTCH2 mRNA上m6A修饰水平显著低于MTCH2-WT,说明该预测的m6A位点是MTCH2 mRNA发生m6A修饰的主要位点。分别在猪肌内前体脂肪细胞中转染MTCH2-WT和MTHC2-MUT质粒并进行成脂诱导,发现MTCH2-MUT组促进脂肪沉积的能力显著低于MTCH2-WT组,同时MTCH2-MUT外源表达的MTCH2蛋白量显著低于MTCH2-WT组,说明MTCH2的m6A修饰能促进肌内脂肪细胞脂肪沉积,可能是通过增强自身蛋白表达发挥作用的。m6A修饰影响蛋白表达主要通过YTH家族蛋白介导,MTCH2-WT和MTCH2-MUT的mRNA lifetime结果表明MTCH2的m6A修饰对其mRNA稳定性无显著影响;在过表达MTCH2-WT的猪肌内脂肪细胞中,干扰YTHDF1组相对于对照组显著抑制了 MTCH2的表达(p<0.05),且猪肌内脂肪细胞内脂肪含量显著下降(p<0.05);但在过表达MTCH2-MUT的猪肌内脂肪前体细胞中,干扰YTHDF1组与对照组相比,MTCH2的表达无显著差异,同时猪肌内脂肪细胞脂肪含量无显著差异。提示:MTCH2的m6A修饰可通过YTHDF1介导而增强其蛋白表达。在猪肌内前体脂肪细胞过表达YTHDF1的情况下检测MTCH2的表达,发现诱导分化24h时,YTHDF1过表达组显著提高了 MTCH2蛋白表达(p<0.05)。Flag-IP-qPCR结果表明MTCH2 mRNA是YTHDF1的靶基因。结果提示:MTCH2的m6A修饰能增强蛋白表达,从而促进猪肌内前体脂肪细胞的成脂分化及脂肪沉积。过程中的蛋白表达,这一过程需要由甲基化阅读蛋白YTHDF1来介导。以上研究结果显示,在猪肌肉组织中存在大量的mRNA m6A修饰,这些甲基化修饰基因主要参与肌肉细胞的分化和代谢等过程。MTCH2是一个金华猪和长白猪背最长肌m6A修饰的差异基因,其m6A修饰能通过YTHDF1介导促进其蛋白表达,进而促进猪肌内脂肪细胞的脂肪沉积。本研究系统地从m6A表观遗传调控方面揭示了猪肌内脂肪沉积相关基因的功能与分子调控机制,这不仅对全方位阐明猪肉质性状遗传与调控的分子机理具有重要科学意义,而且为猪的选育和高效生产提供了科学理论依据。